בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

תקציר

מקור: Ji, Y., et al. A High-Throughput Comet Assay Approach for הערכת נזק לדנ"א תאי. J. Vis. Exp. (2022).

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים לבדיקת השביט

1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ
   1. יש לשפוך אגרוז 1% (w/v) נקודת התכה רגילה [מומס במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O)] בצינור של 50 מ"ל ולחמם במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז ב-ddH₂O. יש לאחסן בטמפרטורה של 37°C כדי למנוע התמצקות לפני ציפוי שקופיות. במקרה של התמצקות, יש להשליך ולהכין טריים.
   2. מיקרוסקופ טרום מעיל מחליק על ידי טבילת המגלשות לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 1% (w/v) נקודת התכה רגילה agarose.
   3. נגב את גב השקופיות במהירות לאחר טבילת המגלשות.
      הערה: אי ניגוב נכון של גב השקופיות יגביר את רעשי הרקע של השקופיות במהלך שלב הניתוח במיקרוסקופ.
   4. תייגו את השקופית המצופה בטוש קבוע בפינה הימנית התחתונה של החלק החלבי (איור 1A). פעולה זו מראה איזה צד של השקופית מצופה מראש.
   5. הניחו לאגרוז להתייצב ולהתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   6. עטפו את השקופיות המיובשות בנייר טישו ואחסנו אותן בקופסה.

2. הכנת דגימות

1. תאים בתרבית
   הערה: ראשית, טפל בתאים עם החומרים המזיקים לפני תחילת בדיקת השביט. לאחר מכן, בצע את הפעולות הבאות.
   1. אם התאים נצמדים, טריפסין את התאים כדי לשחרר אותם מבקבוק תרבית התאים או צלחות פטרי תרבית תאים, במפגש התאים המתאים. נטרלו טריפסין על ידי הוספת מדיה המכילה סרום.
   2. מעבירים את התאים לצינור 50 מ"ל, צנטריפוגה (למשל, עבור HaCaTs, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר), להסיר בעדינות את supernatant, ולהוסיף 1 מ"ל של PBS לכדורית התא.
   3. בצע ספירת תאים.
   4. העבר 30,000 תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 7,607 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
   5. הסר בעדינות את הסופרנאטנט ואחסן את גלולת התא על קרח בחושך לפני ביצוע בדיקת השביט.
      הערה: תאים צריכים להיבדק באופן קבוע עבור זיהום Mycoplasma לפני ביצוע בדיקת השביט כדי למנוע, בין היתר, היווצרות של נזק DNA artefactual ושינוי תגובת נזק DNA, כפי שדווח. תנאי הצנטריפוגה עשויים להשתנות, לפי הצורך, בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש.
2. הכנת תאים בתרבית לבדיקת תיקון
   1. תאי תרבית בבקבוק תרבית התא או בצלחות פטרי.
   2. יש לשטוף את התאים עם 1 מ"ל PBS פעמיים לפני הטיפול בתאים עם חומרים מזיקים (למשל, עבור תאי BE-M17, לטפל עם 50 מיקרומטר של H₂O₂ במשך 20 דקות) על קרח כדי למנוע את התיקון להתרחש במהלך הטיפול.
   3. שטפו את התאים בעדינות עם 1 מ"ל של PBS פעמיים כדי להסיר חומרים מזיקים שיורית.
   4. הכניסו מחדש את מדיום תרבית התאים ואפשרו לתאים לתקן לפרקי זמן משתנים (למשל, 0 דקות, 30 דקות, שעתיים, 6 שעות, 24 שעות ו-30 שעות) באינקובטור לח (37°C, 5% CO₂).
   5. בכל נקודת זמן, אספו 30,000 תאים בתווך תרבית תאים המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
   6. לפני ביצוע בדיקת השביט, הפשיר את התאים במהירות ב 37 ° C באמבט מים וצנטריפוגה אותם ב 7,607 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   7. הסר את הסופרנאטנט ואחסן את גלולת התא על קרח לפני ביצוע הבדיקה (כלומר, משלב 3).

3. ליזה של תאים

הערה: בצע את כל ההליכים על קרח.

1. יש להשתמש ב-12,000 תאים או 2.5 מיקרוליטר דם מלא לג'ל.
2. הכינו 0.6% (w/v) נקודת התכה נמוכה של אגרוז מומס ב-PBS באמצעות מיקרוגל, והניחו באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי למנוע ממנו להתמצק.
3. תייג את הקצה החלבי של השקופיות המצופות מראש עם שם החוקר, תאריך ומידע הטיפול באמצעות טוש קבוע או עיפרון.
4. הניחו צלחת קירור על ספסל שטוח והכניסו את שתי חבילות הקירור הקפואות למגירת ההזזה מתחת למשטח המתכת (כפי שמוצג באיור 2).
5. הניחו את המגלשות על צלחת הקירור והניחו לשקופיות להתקרר מראש למשך 1-2 דקות לפני הוספת נקודת ההתכה הנמוכה של 0.6% (w/v) תאים המכילים אגרוז.
   הערה: השארת המגלשות על צלחת הקירור למשך יותר מ-1-2 דקות עלולה לגרום להיווצרות עיבוי על משטח המגלשה עקב לחות הסביבה. זה עשוי להפוך את נקודת ההתכה הנמוכה ג'ל אגרוז פחות יציב על המגלשות.
6. לפזר את הגלולה (שלב 2.2.7) על ידי מערבולת. ודא שכל הסופרנאטנט הוסר מהכדור. הניחו את מבחנות הדגימה (המכילות את התאים הכדוריים) מיד בחזרה על קרח.
   הערה: בעת הנחת הצינורות המכילים דגימה בצנטריפוגה, הניחו אותם כשהציר פונה כלפי חוץ, כך שהגלולה תיאסף בצד זה של הצינור. לפעמים קשה לראות את הכדור, וקל לעקור אותו תוך כדי הסרת הסופרנטנט. צנטריפוגה עם מכסה הצינור בכיוון זה תאפשר לדעת היכן תהיה גלולת התא.
7. יש להשהות מחדש את כדורית התא עם 200 μL של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 0.6% (LMP agarose) ולערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות. לאחר מכן, להעביר במהירות 80 μL של תאים המכילים אגרוז LMP על שקופית צוננת במהירות להניח כיסוי על הג'ל.
8. מניחים לג'ל להתייצב על צלחת הצינון למשך 1-2 דקות.
9. בינתיים, הכינו תמיסת עבודה של 500 מ"ל של חיץ ליזיס (טבלה 1) ושפכו אותה לתוך צלחת הליזיס (איור 3).
10. לאחר הגדרת הג'לים, הסירו את הכיסויים במהירות על ידי החזקת המגלשה בעדינות בין האגודל לאצבע והחלקת הכיסוי מהג'ל.
11. מקם את השקופיות המכילות דוגמאות בתוך מנשא השקופיות (כל סימוני ה"נקודות" השחורים בשקופיות צריכים לפנות לאותו כיוון כאשר הם ממוקמים במנשא) (איור 1B), ולאחר מכן מקם את מנשא השקופיות בתוך צלחת הליזיס (איור 3).
12. סגרו את מכסה צלחת הליזיס ושמרו את צלחת הליזיס במקרר למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C או 30 דקות בטמפרטורת החדר, לפי לוח הזמנים המתאים ביותר ללוח הזמנים של המפעיל.

4. אלקטרופורזה

1. הסר בזהירות את מנשא השקופיות מצלחת הליזיס. היזהר לא להפריע את הג'לים.
2. הניחו בעדינות את מנשא המגלשה בכלי כביסה טעון מראש ב-ddH₂O קר כקרח והשאירו אותו למשך 30 דקות, תוך הקפדה על כיסוי מלא של המגלשות ב-ddH₂O.
3. הכניסו חבילת קירור קפואה למגירת ההזזה מתחת למיכל האלקטרופורזה כדי לשמור על טמפרטורת חיץ אופטימלית.
4. הוסף בזהירות תמיסת עבודה של אלקטרופורזה קרה כקרח (טבלה 1) למיכל האלקטרופורזה והעבר את נושא ההחלקה למיכל האלקטרופורזה. כוונו את השקופיות כך שהחלקים השקופים שלהן עם הג'לים המכילים תאים (כלומר, לא הקצוות החלביים/מסמנים) יצביעו לכיוון הקתודה (אלקטרודה אדומה).
5. אפשרו למגלשות לשבת במיכל האלקטרופורזה למשך 20 דקות, כך שהדנ"א יירגע ויירגע. השאר את ספק הכוח כבוי במהלך שלב זה.
6. במידת הצורך, הכניסו חבילת קירור קפואה חדשה כדי למקסם את הקירור.
7. בצע אלקטרופורזה במשך 20 דקות במתח של 1.19 וולט/ס"מ, או כל תנאי אחר שעבר אופטימיזציה.
   הערה: אופטימיזציה של תנאי הפעלת אלקטרופורזה ונפח החיץ מומלצת לכל מעבדה. שימוש בנשא שקופיות יחיד בלבד במהלך אלקטרופורזה אינו גורם להשפעה כלשהי של שקופיות על התנגדות מאגר האלקטרופורזה, והמחברים לא ראו השפעה משמעותית במתח או בזרם כאשר מספר השקופיות השתנה.
8. כבה את ספק הכוח, הסר בזהירות את מוביל השקופיות ממיכל האלקטרופורזה ואפשר לו להתנקז על נייר טישו למשך 30 שניות.
9. הניחו את מנשא השקופיות בצלחת המכילה חיץ נטרול (טבלה 1). השאירו אותו למשך 20 דקות.
10. מוציאים את מנשא המגלשה מצלחת הניטרול, מניחים אותו בתבנית הכביסה המכילה ddH2O קר כקרח ומשאירים למשך 20 דקות.
11. הסר את מנשא המגלשה מהמים ואפשר למגלשות להתייבש באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת, או בטמפרטורת החדר למשך הלילה, או לא להתייבש, בהתאם ללוח הזמנים של המפעיל.
    הערה: אם אין ייבוש בשלב 4.11, בצע את שלב הצביעה מ-5.2.

5. צביעת פרופידיום יודיד (PI)

1. מעבירים את מנשא המגלשה לצלחת כביסה המכילה ddH₂O קר כקרח כדי להחזיר לחות למגלשות ולהשאיר למשך 30 דקות.
2. הניחו את מנשא השקופיות בכלי צביעה המכיל תמיסת פרופידיום יודיד 2.5 מיקרוגרם/מ"ל.
   הערה: פרופידיום יודיד רגיש לאור, לכן יש לטפל בו באזור חשוך. זה גם רעיל.
3. סוגרים את מכסה צלחת הכתמים ודגרים עליה במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
4. העבירו את מנשא המגלשה לצלחת נפרדת, ושטפו אותו עם ddH קר כקרח₂O למשך 20 דקות.
5. הסר את מנשא המגלשה מהצלחת וייבש אותו לחלוטין בחושך, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר, בהתאם ללוח הזמנים או להעדפת המפעיל.
6. לאחר ייבוש מלא של השקופיות, הסר אותן ממנשא השקופיות ואחסן אותן בתיבת שקופיות בחושך עד שהן מוכנות לניתוח תמונות.
   הערה: השקופיות יישארו קריאות ללא הגבלת זמן וניתן יהיה להכתים אותן מחדש במידת הצורך.

6. ניקוד שביט וניתוח נתונים

הערה: המונח "שביט" נגזר מתמונות של תאים פגומים כאשר צופים תחת מיקרוסקופ לאחר ביצוע הבדיקה (איור 4). בתנאי אלקטרופורזה, הדנ"א בתאים שלא ניזוקו ברובו אינו נודד, אלא נשאר בכדוריד המכונה "ראש שביט". אולם נוכחותם של שברי גדילים מאפשרת לדנ"א של התא לנדוד החוצה מהראש וליצור "זנב", מה שמוביל להופעה כמו כוכב שביט (איור 4). ככל שיש יותר דנ"א בזנב, כך קיים יותר נזק.

1. הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות מסנן PI (אדום) (λ = 536/617 ננומטר) ותוכנת הניקוד לבדיקת שביט.
2. מוסיפים טיפת מים בעזרת פיפטת פסטר לג'ל ומכסים בכיסוי.
3. הכניסו את המגלשות למיקרוסקופ הפלואורסצנטי ו"ניקודו" את השביטים.
   הערה: ניקוד הוא אמצעי שבאמצעותו מעריכים את כוכבי השביט, כדי לקבוע את מידת הנזק הקיימת בכל כוכב שביט. באופן כללי, ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשתי גישות, בהתאם להעדפה הנבחרת של המשתמש, או על ידי עין (מדידת גודל השביטים בסולם של אפס עד ארבע) או על ידי שימוש חופשי, או בתוכנה זמינה מסחרית30. באופן כללי, שתי הגישות מעריכות את גודל זנב השביט, אם כי ניתן לקבוע מגוון של נקודות קצה הקשורות לשביט. אם אתם משתמשים בתוכנה, לחצו על אמצע ראש השביט והמתינו עד שהתוכנה תזהה את השביט באופן אוטומטי, ואז תעריכו את נקודת הקצה שנבחרה (איור 4).
4. ציון 50 שביטים לג'ל ו-100 שביטים לדגימה (כלומר, כל דגימה מתאימה לטיפולים שונים הפוגעים בדנ"א, או להעתקים שלהם).
5. לשכפל את הניסויים (n = 2) או לשלש את הניסויים (n = 3).
   הערה: אם רק n=2 ניסויים משוכפלים מתבצעים, ניתוח סטטיסטי לא יכול להתבצע, אבל אם n=3, לבצע את מבחן נורמליות D'agostino. רוב נתוני בדיקת השביט אינם עוברים מבחן תקינות. במקרה זה, השתמש במבחן לא פרמטרי (מבחן קרוסקל-וואליס עם מבחן השוואות מרובות של דאן, ומבחן מאן-ויטני מובהקות נקבע על p < 0.05).

מגיב	פתרון מלאי	פתרון עבודה
חיץ ליזיס	100 mM Na2EDTA, 2.5 M NaCl ו- 10 mM Tris Base ב- ddH2O; כוונן את ה- pH ל- 10 עם 10 M NaOH	1% Triton X-100 בתמיסת מניות lysis
חיץ אלקטרופורזה	10 M NaOH ו- 200 mM Na2EDTA ב- ddH2O	300 mM NaOH ו- 1 mM Na2EDTA; pH > 13
חיץ נטרול	0.4 מ' בסיס Tris ב-ddH2O; כוונן את ה-pH ל-7.5 עם HCl
חיץ צביעה	1 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד	2.5 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד ב-ddH2O

טבלה 1: הרכב ריאגנטים המשמשים בבדיקת שביט אלקליין בתפוקה גבוהה (HTP ACA). מלאי וריכוזי עבודה של ליזיס, אלקטרופורזה, נטרול ומאגרי כתמים מוצגים.

תוצאות

איור 1: תמונות מייצגות של שקופית בדיקת שביט וארון תקשורת HTP (נשא שקופיות במיקרוסקופ). (A) עבור כיוון נכון, הפנים המצופים מראש של שקופית המיקרוסקופ מזוהים על-ידי נקודה שחורה בפינה הימנית של שקופית מיקרוסקופ. (B) התמונה של ארון התקשורת HTP מדגימה כיצד השקופיות נשמרות בכיוון אנכי הדוק, עם לשוניות על המוביל כדי לתקן את הכיוון שלו בתוך מיכל האלקטרופורזה. כל מפעיל סלולרי יכול להכיל עד 25 מגלשות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסויי זכוכית 22 x 22 מ"מ	Fisher Scientific, המפטון, ניו המפטון, ארה"ב (ארצות הברית)	631-0124
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד עם מצלמה	Zeiss, Jena, גרמניה
מערכת HTP Comet Assay	קליבר סיינטיפיק	COMPAC- 50
קרטינוציטים אנושיים (HaCaTs)	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי (ATCC), מנסאס, וירג'יניה, ארה"ב	הופסק	ניתן לרכוש מ אחר חברה ADDEXBIO TECHNOLOGIES חתול# T0020001
מי חמצן (H2O2) 30% במים	Fisher Scientific, המפטון, ניו המפטון, ארה"ב (ארצות הברית)	BP2633-500
תוכנה לניתוח תמונות ונתונים	מכשיר תפיסתי, ברי סנט אדמונדס, אנגליה, בריטניה	125525	תוכנת ניתוח תמונה חינמית היא זמין לדוגמה, ImageJ
נקודת התכה נמוכה אגרוז	Invitrogen Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	P4864
Na2 EDTA (disodium חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית)	Sigma Aldrich, סנט לואיס, MO, ארצות הברית	E5134
NaCl (נתרן כלורי)	Sigma Aldrich, סנט לואיס, MO, ארצות הברית	S7653
Nanopure Infinity Ultrapure Water מערכת (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, ארצות הברית	D11901	מים טהורים במיוחד (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (נתרן הידרוקסידי)	Sigma Aldrich, סנט לואיס, MO, ארה"ב (ארצות הברית)	E5134
נקודת התכה רגילה אגרוז	Fisher Scientific, Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)	16520100	לציפוי מקדים של שקופיות
Propidium Iodide (1.0 מ"ג/מ"ל במים)	Sigma Aldrich, סנט לואיס, MO, ארצות הברית	12-541BP486410ML
מיקרוסקופ זכוכית חד-חלבית שקופיות	Fisher Scientific, Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)	12-541ב
תיבת שקופית	Fisher Scientific, Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)	03-448-2	עמיד לאור, להגנה על התאים מ ההיווצרות נזק הרפתקני (על פי הדעה הרווחת) ולמנוע דהיית פלורסנט צבע
צלחת מצננת מחליקה	Cleaver Scientific, רוגבי, אנגליה, בריטניה	CSL-CHILLPLATE
צלחת טיפול	Cleaver Scientific, רוגבי, אנגליה, בריטניה	STAINDISH4X
בסיס טריס	Sigma Aldrich, סנט לואיס, MO, ארצות הברית	93362
טריטון X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)	BP151-500
טריפסין EDTA (0.5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	15400054
מנשא החלקה אנכי	Cleaver Scientific, רוגבי, אנגליה, בריטניה	COMPAC-25