מאמר שיטה

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Ji, Y., et al. A High-Throughput Comet Assay Approach for הערכת נזק לדנ"א תאי. J. Vis. Exp. (2022).

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חומרים לבדיקת השביט

  1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ
    1. יש לשפוך אגרוז 1% (w/v) נקודת התכה רגילה [מומס במים מזוקקים פעמיים (ddH2O)] בצינור של 50 מ"ל ולחמם במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז ב-ddH2O. יש לאחסן בטמפרטורה של 37°C כדי למנוע התמצקות לפני ציפוי שקופיות. במקרה של התמצקות, יש להשליך ולהכין טריים.
    2. מיקרוסקופ טרום מעיל מחליק על ידי טבילת המגלשות לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 1% (w/v) נקודת התכה רגילה agarose.
    3. נגב את גב השקופיות במהירות לאחר טבילת המגלשות.
      הערה: אי ניגוב נכון של גב השקופיות יגביר את רעשי הרקע של השקופיות במהלך שלב הניתוח במיקרוסקופ.
    4. תייגו את השקופית המצופה בטוש....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: תמונות מייצגות של שקופית בדיקת שביט וארון תקשורת HTP (נשא שקופיות במיקרוסקופ). (A) עבור כיוון נכון, הפנים המצופים מראש של שקופית המיקרוסקופ מזוהים על-ידי נקודה שחורה בפינה הימנית של שקופית מיקרוסקופ. (B) התמונה של ארון התקשורת HTP מדגימה כיצד השקופיות נשמרות בכיוון אנכי הדוק, עם לשוניות על המוביל כדי לתקן את הכיוון שלו בתוך מיכל האלקטרופורזה. כל מפעיל סלולרי יכול להכיל עד 25 מגלשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כיסויי זכוכית 22 x 22 מ"מFisher Scientific, המפטון, ניו המפטון, ארה"ב (ארצות הברית)631-0124
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד
עם מצלמה		Zeiss, Jena, גרמניה
מערכת HTP Comet Assayקליבר סיינטיפיקCOMPAC- 50
קרטינוציטים אנושיים (HaCaTs)אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי
(ATCC), מנסאס, וירג'יניה, ארה"ב		הופסקניתן לרכוש מ
אחר חברה
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
חתול# T0020001
מי חמצן (H2O2)
30% במים		Fisher Scientific, המפטון, ניו המפטון, ארה"ב (ארצות הברית)BP2633-500
תוכנה לניתוח תמונות ונתוניםמכשיר תפיסתי,
ברי סנט אדמונדס, אנגליה,
בריטניה		125525תוכנת ניתוח תמונה חינמית היא
זמין לדוגמה, ImageJ
נקודת התכה נמוכה אגרוזInvitrogen
Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)		P4864
Na2 EDTA (disodium
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית)		Sigma Aldrich,
סנט לואיס, MO,
ארצות הברית		E5134
NaCl (נתרן כלורי)Sigma Aldrich,
סנט לואיס, MO,
ארצות הברית		S7653
Nanopure Infinity Ultrapure Water
מערכת (Barnstead Nanopure)		Thermo Scientific,
Waltham, MA,
ארצות הברית		D11901מים טהורים במיוחד (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (נתרן הידרוקסידי)Sigma Aldrich,
סנט לואיס, MO, ארה"ב (ארצות הברית)		E5134
נקודת התכה רגילה אגרוזFisher Scientific,
Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)		16520100לציפוי מקדים של שקופיות
Propidium Iodide
(1.0 מ"ג/מ"ל במים)		Sigma Aldrich,
סנט לואיס, MO,
ארצות הברית		12-541BP486410ML
מיקרוסקופ זכוכית חד-חלבית
שקופיות		Fisher Scientific,
Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)		12-541ב
תיבת שקופיתFisher Scientific,
Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)		03-448-2עמיד לאור, להגנה על התאים מ
ההיווצרות נזק הרפתקני
(על פי הדעה הרווחת)
ולמנוע דהיית פלורסנט
צבע
צלחת מצננת מחליקהCleaver Scientific,
רוגבי, אנגליה,
בריטניה		CSL-CHILLPLATE
צלחת טיפולCleaver Scientific,
רוגבי, אנגליה,
בריטניה		STAINDISH4X
בסיס טריסSigma Aldrich,
סנט לואיס, MO,
ארצות הברית		93362
טריטון X-100Fisher Scientific,
Hampton, NH, ארה"ב (ארצות הברית)		BP151-500
טריפסין EDTA (0.5%)Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)		15400054
מנשא החלקה אנכיCleaver Scientific,
רוגבי, אנגליה,
בריטניה		COMPAC-25

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים