השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) מחייב אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד.
1. ספיגת חומצות אמינו בתאים
- צלחת 5 x 104 תאי ST2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 באר. תאי צלחת ב-α-MEM המכילים 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Pen/Strep). לוחית בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציה בשלב 1.12. לדגור על תאים באינקובטור תרבית תאים לח ב 37 ° C עם 5% CO2.
- תרבית את התאים במשך 2-3 ימים עד למפגש.
- ביום הניסוי, הכינו את התמיסות הבאות: 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS), pH 7.4 וחיץ Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). חימום מראש ל 37 °C (77 °F).
- שואפים את המדיום ושוטפים את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS, pH 7.4.
הערה: פרוטוקול זה מתאים גם לחלוקה מהירה של תאים שאינם שוטפים. במקרה זה, חשוב לנרמל את הרדיואקטיביות למספר תאים מוחלט או תוכן DNA. בנוסף, שקול להגדיל את גודל צלחת התרבית או הבקבוק כדי להגדיל את מספר התאים הכולל ואת ערכי ה- CPM. זה חשוב לקבוע אמפירית על בסיס אישי.
- שאפו 1x PBS ושטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל KRH.
- הפוך 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-גלוטמין מדיה עבודה על ידי דילול 4 μL של [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-מלאי גלוטמין לכל 1 מ"ל של KRH.
הערה: לפני השימוש בחומרים רדיואקטיביים, אנא צור קשר עם המשרד לבטיחות קרינה במוסד הבית שלך לקבלת אישורים. כל ההליכים הקשורים לקרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס.
- לדגור על תאים עם 0.5 מ"ל של KRH המכיל 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-גלוטמין מדיה עבודה במשך 5 דקות.
- יש לאסוף את התווך הרדיואקטיבי ולפזר למיכל הפסולת הנוזלית. שטפו את התאים שלוש פעמים לזמן קצר עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה. יש לאסוף ולהשליך את כל השטיפות במיכל הפסולת הנוזלית הרדיואקטיבית.
- הוסף 1 מ"ל של 1% SDS לכל באר ו triturate 10x כדי lyse ו homogenize התאים. להעביר את התא lysates ל 1.5 מ"ל צינורות. השליכו את לוחות תרבית התאים, פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטה במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.
- צנטריפוגה >10,000 x גרם למשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנטים לבקבוקוני נצנוץ המכילים 8 מ"ל של תמיסת הנצנצים. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. יש להשליך צינורות וקצות פיפטה במיכל פסולת רדיואקטיבית מוצקה.
- קרא רדיואקטיביות בספירה לדקה (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך בקבוקוני נצנוץ במיכל פסולת בקבוקון.
- טריפסיניזציה, השהיה מחדש וספירת התאים מהלוחות הלא-רדיואקטיביים הנותרים של תאים (ראה שלב 1.1) כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות הליזיות. באמצעות המוציטומטר, לספור את מספר התאים לכל באר לא רדיואקטיבית עבור כל תנאי ניסוי. נרמל את ה- CPM משלב 1.11 למספר התא המשוער מהלוחות הלא רדיואקטיביים.
- לאחר השלמת הניסוי, לטהר את מכסה המנוע של תרבית התא, הספסל וכל המכשירים באמצעות תרסיס מזהם רדיואקטיבי. לבסוף, בצעו בדיקות מגבון כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.
