בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

תקציר

מקור: Yanase, S., et al. בדיקות קולורימטריות בקנה מידה קטן של לקטט תוך תאי ופירובט בנמטודה Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

פרוטוקול

1. תרבות מסונכרנת של C. elegans

1. לפני הזריעה, תרבית את זן Escherichia coli (E. coli) OP50 למשך הלילה ב 37 ° C ב 300 מ"ל של Luria-Bertani (LB) מרק בינוני נוזלי. אחסנו את OP50 המתורבת בטמפרטורה של -4°C.
   1. כדי להפוך את מרק LB למדיום נוזלי, השתמשו ב-10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם NaCl ו-1.5 מ"ל של 1 N NaOH, והוסיפו ל-1 ליטר עם מים נטולי יונים. Autoclave.
      הערה: זני OP50 ו-C. elegans זמינים במרכז Caenorhabditis Genetics Center (אוניברסיטת מינסוטה, סנט פול, מינסוטה, ארה"ב).
2. כדי ליצור אגר בינוני גידול נמטודות (NGM), השתמש 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של פפטון, 17 גרם של אגר, ו 975 מ"ל של מים deionized. אוטוקלאב. מצננים ל-55°C, ואז מוסיפים באופן סטרילי, לפי הסדר, 1 מ"ל של 1 M MgSO₄, 1 מ"ל של 1 M CaCl₂, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול ב-EtOH, ו-25 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט pH 6.0 בצלחות פטרי 90 מ"מ.
   1. עבור 1 M אשלגן פוספט pH 6.0, להשתמש 108.3 גרם של KH₂PO₄ ו 46.6 גרם של K₂HPO₄, ולהוסיף מים deionized 1 L. Autoclave.
3. מורחים 1-2 מ"ל של OP50 מתורבת על לוחות אגר NGM. ליצירת שכבה דקה של OP50, יש לדגור על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני הוספת נמטודות.
   הערה: ניתן לאחסן את צלחות אגר NGM OP50 בטמפרטורת החדר למשך 2-3 שבועות.
4. הוסיפו לפחות 100 תולעים לצלחת אגר NGM עם OP50, ותרביתו בטמפרטורה של 20°C עד לשלב הבוגר. נדרשות לפחות שלוש צלחות.
5. כדי לאסוף ביצים ברחם, להעביר hermaphrodites gravid משלוש צלחות אגר NGM כל אחד עם 5 מ"ל של חיץ S בצינור חרוטי 15 מ"ל, ולשטוף את התולעים 3 פעמים עם 15 מ"ל של חיץ S באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 s בטמפרטורת החדר.
   1. כדי ליצור חיץ S, השתמש 5.9 גרם של NaCl ו 50 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט pH 6.0, ולהוסיף 1 L עם מים deionized. אוטוקלאב.
6. ממיסים את התולעים בתמיסת היפוכלוריט אלקליין לצורך אקסניזציה ובידוד ביצים בתפזורת (0.5 מ"ל אקונומיקה טרייה או שווה ערך: 5-6% נתרן היפוכלוריט, 0.1 מ"ל של 10 M NaOH, כ-4.5 מ"ל של חיץ S), והעמידו את התמיסה למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב על ידי היפוך.
   הערה: תוך 15 דקות, התולעים הבוגרות אמורות להתמוסס, ולהשאיר תמיסה מעורפלת של ביצים משוחררות מפגריהן (יש לאשר את הביצים המשוחררות באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי). במקום 0.1 מ"ל של 10 N NaOH, ניתן להשתמש גם ב-0.2 מ"ל של 5 N NaOH.
7. לאחר טיפול hypochlorite, לשטוף את גלולת הביצה 3 פעמים עם 15 מ"ל של חיץ S, ו resuspend ב 5-6 מ"ל של חיץ S. בוקעים את הביצים ששוחררו במהלך דגירה של לילה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במאגר S ללא E. coli לקבלת תרבית סינכרונית לגיל של זחלי שלב L1.
8. כדי לקבוע את המספר המשוער של זחלי שלב L1, ספרו את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי בחיץ S של 10 μL לאחר השעיית הזחלים לפחות 3 פעמים, וחשבו את הממוצע. לאחר מכן, מעבירים את הזחלים בשלב L1 לחמש צלחות אגר NGM עם OP50 (1,500-3,000 תולעים לצלחת באמצעות צלחת פטרי 90 מ"מ), ותרבית בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהם גדלים לשלב הבוגר הצעיר בו מתחילה ההפריה העצמית ומוטלות כמה ביצים (בדרך כלל לאחר 3 ימים).

2. מיצוי מקטע תאי מ- C. elegans

1. אספו את התולעים בשלב הבוגר הצעיר (חיות בנות 5 ימים) מחמש צלחות אגר NGM עם חיץ S (איור 1A).
   1. כדי לבחור רק תולעים חיות בשיטת סוכרוז 6 להנפקה על 30% (w/v) סוכרוז, ערבבו את התולעים המרחפים בחיץ S של 3-4 מ"ל עם נפח שווה של 60% סוכרוז קר כקרח (w/v) בצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובבו את הצינור במהירות של 1,500 x גרם למשך 15 שניות ב-4°C והוציאו את התולעים הצפות לתוך צינור טרי על ידי העברתן מדופן הצינור עם פיפטה של פסטר.
2. שטפו את התולעים 3 פעמים עם חיץ S באמצעות צנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם למשך 30 שניות ב-4°C. בדקו את הנפח הרטוב של תולעים שטופות לאחר צנטריפוגה באמצעות קצה מיקרופיפטה של 1,000 μL (איור 1B).
3. הוסיפו את התולעים שנשטפו לנפח שווה של חומצה טריכלורואצטית (TCA; ריכוז סופי של 5%) עבור משקעים חלבוניים (איור 1C). במקום TCA, ניתן להשתמש בחומצה פרכלורית (PCA) או בחומצה מטפוספורית.
4. הומוגניזציה של התולעים עם המשקע באמצעות 40 משיכות של מזיק בהומוגנייזר טפלון (מטחנת רקמות פוטר-אלווהיים) עם סיבוב של עד 1,300 סל"ד על קרח.
5. מעבירים את ההומוגנאט למיקרו-צינור טרי בנפח 1.5 מ"ל עם פיפטה של פסטר, ויוצרים סוניקציה באמצעות הומוגנייזר על-קולי למשך 3 דקות (3 פעמים של דקה) עם מחזור עבודה של 20% על קרח.
6. להבהיר את ההומוגנט על ידי צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. נטרל את supernatants עם 4 M KOH (0.25 נפח עד 10% TCA) במשך 20 דקות על קרח, וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. ניתן לאחסן את הסופרנאטנט (כדגימת בדיקה) בטמפרטורה של -80°C עד לבדיקות הבאות.

3. בדיקת לקטט באמצעות ערכת בדיקה קולורימטרית

1. למדוד את ריכוז הלקטט בדגימות הבדיקה באמצעות ערכת בדיקה קולורימטרית (טבלה של חומרים). לבצע בדיקות דופלקס עבור דגימות הבדיקה. הוסף 5 או 10 μL של דגימות הבדיקה לצלחת 96 באר והתאם את הנפח ל 50 μL לכל באר עם מאגר Lactate Assay שסופק עם הערכה.
2. עבור עקומת תקן לקטט, יש לדלל 100 mM L(+)-Lactate Standard ל-1 mM באמצעות Lactate Assay Buffer. הוסף 0, 2, 4, 6, 8 ו- 10 μL של תקן 1 mM L(+)-Lactate, המסופק עם הערכה, לסדרה של בארות.
3. יש להוסיף 50 μL של תערובת תגובה (המכילה 46:2:2 של מאגר לקטט, תערובת אנזימי לקטט ובדיקת לקטט ב-DMSO, נטול מים; כל הריאגנטים מסופקים עם הערכה) או תערובת בקרת רקע (המכילה 48:2 של Lactate Assay Buffer ו-Lactate Probe) לכל באר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות כאשר הדגימות מוגנות מפני אור.
4. מדוד את הספיגה של כל באר ב- 570 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות והפחת את הספיגה של תערובת בקרת הרקע מהספיגה של תערובת התגובות.
5. התווה את עקומת תקן הלקטט. חישוב ריכוזי הלקטט של דגימות הבדיקה מעקומת תקן לקטט.

תוצאות

איור 1. תהליך להפקת מטבוליטים תאיים. (A) 1,500-3,000 תולעים הונחו על צלחת אגר NGM (צלחת פטרי 90 מ"מ). מיצוי מתולעים על חמש צלחות הספיק לבדיקות קולורימטריות. (B) תולעים שנאספו מחמש לוחיות של 3,000 ו-1,500 תולעים בכל צלחת מסומנות בצד שמאל וימין של הלוח, בהתאמה. שני הנפחים הרטובים בכל צינור של 15 מ"ל הם < 0.5 מ"ל, שהספיקו לגילוי. (C)...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת בדיקת Lactate Colorimetric/Fluorimetric	ביוויז'ן	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 בדיקות; יש לאחסן בטמפרטורה של -20oC
חומצה טריכלורואצטית	Wako כימיקל טהור	#207-04955	יש לאחסן בטמפרטורת החדר
הומוגנייזר טפלון	איוואקי/פירקס	#358034 (Wheaton)	במקום איוואקי/פירקס זמין על ידי Wheaton