בדיקה ספקטרופוטומטרית לקביעת פעילות גליקוגן סינתאז

תקציר

מקור: Wilson W.A., Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר בדיקה ספקטרופוטומטרית להערכת פעילות גליקוגן סינתאז. השיטה מסתמכת על ירידה בספיגת NADH עם הזמן ומצביעה על פעילות גליקוגן סינתאז.

פרוטוקול

1. קביעת פעילות גליקוגן סינתאז

1. הכנת תמיסות מלאי של ריאגנטים נדרשים כמצוין בטבלה 1 (לפני יום הניסוי).
2. ביום הבדיקה, הכינו תמיסת עבודה חדשה של 4 מילימול NADH על ידי המסת 4.5 מ"ג של NADH ב-1.5 מ"ל של 50 מילימטר Tris-HCl, pH 8.0. יש לאחסן על קרח, מוגן מפני האור.
3. הפשירו תמיסות מלאי של UDP-גלוקוז, ATP, פוספונולפירובט ו-NDP קינאז על קרח.
4. מחממים מראש אמבט מים ל 30 מעלות צלזיוס.
5. הגדר כל בדיקת גליקוגן סינתאז בצינור של 1.5 מ"ל על-ידי הוספת ריאגנטים של תערובת התגובה המפורטים בטבלה 2.
   הערה: כדי להקל על ההגדרה, ניתן ליצור תערובת אב המכילה מספיק מכל אחד מהריאגנטים המפורטים לעיל כדי להשלים את מספר הבדיקות המתוכננות.
6. הכינו תגובה ריקה, שבה NADH בתערובת לעיל מוחלף במים. מעבירים לקובט מתקרילט חד פעמי ומשתמשים בו כדי להגדיר את האפס על הספקטרופוטומטר על 340 ננומטר.
7. קח אחד 770 μL של aliquot של תערובת תגובה בצינור 1.5 מ"ל. יש להוסיף 2 μL של NDP קינאז ו-2 μL של תערובת פירובט קינאז/לקטט דהידרוגנאז, לערבב בעדינות ולדגור בטמפרטורה של 30°C למשך 3 דקות כדי לחמם מראש את תערובת התגובה.
8. הוסף 30 μL של הדגימה המכילה גליקוגן סינתאז ב 20 mM Tris buffer, pH 7.8; מערבבים, ומעבירים את תערובת התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי.
9. הכניסו את הקובט לספקטרופוטומטר ורשמו את הספיגה ב-340 ננומטר במרווחי זמן של 10 עד 20 דקות. התווה את הספיגות המתקבלות כנגד הזמן.
   הערה: תגובה שבה דגימת הגליקוגן סינתאז מוחלפת בחיץ Tris של 20 mM צריכה להתבצע כדי לשלוט בחמצון לא אנזימטי של NADH. בהתאם לטוהר הדגימה, ייתכן שיידרשו תגובות בקרה אחרות.
10. קבע את קצב התגובה.

טבלה 1: פתרונות מלאי הנדרשים לבדיקת פעילות גליקוגן סינתאז.

רכיב	כיוונים
50 מ"מ טריס pH 8.0	להמיס 0.61 גרם של בסיס Tris ב~ 80 מ"ל מים. מצננים ל-4°C. כוונן את ה-pH ל-8.0 עם HCl והפוך את עוצמת הקול ל-100 מ"ל עם מים.
חיץ HEPES של 20 מ"מ	להמיס 0.477 גרם HEPES ב~ 80 מ"ל מים. התאם את ה- pH ל- 7.0 עם NaOH והפצה את עוצמת הקול ל -100 מ"ל עם מים.
132 mM Tris/32 mM KCl חיץ pH 7.8	להמיס 1.94 גרם בסיס Tris ו-0.239 גרם KCl ב~90 מ"ל מים. התאם את ה- pH ל- 7.8 עם HCl והפצה את עוצמת הקול ל- 100 מ"ל עם מים.
0.8% עם גליקוגן אויסטר	לשקול 80 מ"ג גליקוגן צדפות ולהוסיף למים. הפוך את הנפח הסופי עד 10 מ"ל עם מים לחמם בעדינות / לערבב כדי להמיס גליקוגן לחלוטין.
100 מ"מ UDP-גלוקוז	ממיסים 0.31 גרם של גלוקוז UDP במים והופכים את הנפח הסופי עד 1 מ"ל. יש לאחסן ב aliquots, קפוא ב -20 °C. יציב במשך מספר חודשים.
50 מ"מ ATP	להמיס 0.414 גרם ATP ב~ 13 מ"ל מים. כוונן את ה- pH ל- 7.5 עם NaOH והפצה את עוצמת הקול ל -15 מ"ל עם מים. יש לאחסן ב aliquots קפוא ב -20 °C. יציב במשך מספר חודשים.
100 מ"מ גלוקוז-6-פוספט pH 7.8	להמיס 0.282 גרם גלוקוז-6-פוספט ב~ 7 עד 8 מ"ל מים. כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם NaOH. הפוך את נפח עד 10 מ"ל עם מים. יש לאחסן קפוא ב aliquots ב -20 °C. יציב לפחות שישה חודשים.
40 מ"מ פוספונולפירובט	להמיס 4 מ"ג של phosphoenolpyruvate ב 0.5 מ"ל של 20 mM HEPES חיץ pH 7.0. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יציב למשך שבוע אחד לפחות.
0.5 מטר MnCl2	להמיס 9.90 גרם של MnCl2 בנפח סופי של 100 מ"ל מים.
NDP קינאז	הרכיבו מחדש אבקה ליופילית עם מספיק מים כדי לתת תמיסת U/μl אחת. הכינו aliquots, להקפיא בחנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C. יציב לפחות 1 שנה.

טבלה 2: תערובת תגובת הרכב לבדיקת פעילות גליקוגן סינתאז.

רכיב	נפח (μl)
160 mM Tris/32 mM חיץ KCl pH 7.8	250
מים	179
100 מילימטר גלוקוז-6-פוספט, pH 7.8	58
0.8% עם גליקוגן צדפות	67
50 מ"מ ATP	80
4 מ"מ NADH	80
100 מ"מ UDP-גלוקוז	28
40 מ"מ פוספונולפירובט	20
0.5 מטר MnCl2	8
נפח סופי	770

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עמילופקטין (ללא עמילוז) מתירס שעווה	פישר סיינטיפיק	A0456
אמילוז	ביוסינת' קרבוסינתוס	YA10257
ATP, מלח דיסודיום	MilliporeSigma	A3377
D-גלוקוז-1,6-ביספוספט, מלח אשלגן	MilliporeSigma	G6893
D-גלוקוז-6-פוספט, מלח נתרן	MilliporeSigma	G7879
גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז, דרגה I, משמרים	MilliporeSigma	10127655001
גליקוגן, סוג II מצדפה	MilliporeSigma	G8751
הקסוקינאז	MilliporeSigma	11426362001
קובטות מתקרילט, 1.5 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-955-128	Methacrylate נדרש מאז כמה הליכים נערכים ב 340 ננומטר או פחות
β-ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט נתרן מלח	MilliporeSigma	N0505
β-ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד, מלח דיסודיום מופחת	MilliporeSigma	43420
נוקלאוזיד 5'-דיפוספט קינאז	MilliporeSigma	N0379
פוספונולפירובט, מלח מונופוטסיום	MilliporeSigma	עמ' 7127
Phosphoglucomutase משריר ארנב	MilliporeSigma	עמ' 3397
פוספורילאז A משריר ארנב	MilliporeSigma	עמ' 1261
אנזימי פירובט קינאז/לקטיק דהידרוגנאז משריר הארנבת	MilliporeSigma	P0294
UDP-גלוקוז, מלח דיסודיום	MilliporeSigma	U4625