ניתוח מבוסס עכבה תאית לניטור תהליכים תאיים בזמן אמת

תקציר

מקור: Labadie, T., et al., <a href="https://app.jove.com/v/61133">ניטור הישרדות נגיף השפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה אנו מדגימים את התהליך של ניטור בזמן אמת של אירועים תאיים, כולל התפשטות של תאים דבקים, באמצעות בדיקת עכבה תאית. כאן, התאים הדבקים פועלים כמבודדים, מגבילים את זרימת הזרם בין האלקטרודות ומגבירים את העכבה.

פרוטוקול

הערה: במהלך כל הניסויים, שמור את הלוחות על משטחים לא אלקטרוסטטיים בכל עת, כגון עטיפות הנייר מהאריזה. עקוב אחר סעיף 1 להלן כדי לקבוע את הריכוז המתאים ביותר של תאים שיש לזרוע בלוח המיקרוטיטר האלקטרוני (שתוכנן כ- E-Plate).

1. קביעת כמות תאים מתאימה לתאים מדביקים

1. הכינו תאי MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) ב-75 ס"מ² צלוחיות כדי לקבל תאים מפוצלים טריים (כ-80% מפגש) 24 שעות לפני הניסוי.
2. לשטוף תאים עם 5 מ"ל של 1x PBS ולנתק אותם על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA.
3. הוסף 7 מ"ל של מדיום תרבית תאים טרייה וספור תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי עם צביעה כחולה טריפאן.
4. התאם את ריכוז התא ל- 400,000 תאים/מ"ל באמצעות מדיית תרבית תאים. לבצע דילולים סדרתיים כפולים בצינורות נוספים כדי להשיג צפיפות תאים של 200,000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; ו-6,250 תאים/מ"ל. התאמת טווח הדילול של התאים בהתאם לסוג התא והתנהגות הצמיחה שלהם.
5. השאירו את צלחת ה-E (טבלת החומרים) ב-RT למשך מספר דקות והוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיה לתרבית תאים לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. אין לגעת באלקטרודות של לוח ה-E.
6. פתחו את נעילת העריסות והכניסו את הקצה הקדמי של הצלחת לכיס העריסה של מכשיר מדידת העכבה (Table of Materials). סגור את דלת האינקובטור.
7. פתח את התוכנה.
   1. ב"הגדרת תבנית ניסוי המוגדרת כברירת מחדל", בחר את העריסות שנבחרו ולחץ פעמיים על העמוד העליון ולאחר מכן הזן את שם הניסוי. לחץ על "פריסה" והזן את המידע לדוגמה הדרוש עבור כל באר שנבחרה של הצלחת; לאחר מכן, לחץ על "החל" בסיום. לחץ על "תזמון" | "שלבים" | "הוסף שלב". התוכנה מוסיפה באופן אוטומטי צעד של 1 שניות כדי למדוד את עכבת הרקע (CI).
   2. לחץ על "התחל / המשך" בכרטיסייה "ביצוע". לחץ על "מגרש", הוסף את כל הדגימות על ידי בחירת הבארות שהותאמו, וודא CI הוא בין -0.1 ל -0.1 לפני שתמשיך לשלב הבא.
8. מוציאים את הצלחת מהעריסה.
9. הוסף 100 μL של כל תרחיף תאים משלב 1.4 בשכפול לבארות המתאימות ו- 100 μL של מדיה תאית בבארות המשמשות כבקרות. השאירו את לוח ה-E במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך 30 דקות ב-RT כדי לאפשר פיזור אחיד של התאים בתחתית הבארות.
10. הכנס את צלחת ה- E לכיס העריסה. לחץ על "תזמון" | "הוסף שלב" בתוכנה והזן ערכים לניטור תאים כל 30 דקות במשך 200 חזרות. לאחר מכן, בחר "התחל/המשך".
11. בדוק והתווה את נתוני CI על ידי לחיצה על כפתור "Plot" בתוכנה. בחר את ריכוז התאים שנמצאים ממש לפני השלב הנייח 24 שעות לאחר הזריעה על הצלחת, על מנת לקבל תאים שעדיין נמצאים בשלב גידול במהלך זיהום ויראלי. השלב הנייח מגיע כאשר CI נמצא במקסימום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת E 16 (6 צלחות)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	לוחות אלקטרוניים זמינים באריזות שונות
PBS 1X	טכנולוגיות חיים (gibco)	14040091
TPCK-טריפסין	וורטינגטון	LS003740
xCELLigence מכשיר ניתוח תאים בזמן אמת S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	מכשירי xCELLigence RTCA S16 זמינים בפורמטים שונים (16-well, 96-well, יחיד או multi-plate)
בקבוק תרבית רקמה 75 סמ"ר	בז	430641U
MEM 1X	טכנולוגיות חיים (gibco)	31095029