בדיקה סלולרית מבוססת עכבה למדידת ריבוי הדבקה בנגיף השפעת

תקציר

מקור: Labadie, T., et al., <a href="https://app.jove.com/v/61133">ניטור הישרדות נגיף השפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו דנים בקורלציה בין CIT₅₀ לבין ריבוי זיהומים ויראליים. התאים הנגועים בנגיף מציגים השפעות ציטופתיות, הגורמות למותם ולניתוקם מהמיקרואלקטרודה המוזהבת, שבתורה מפחיתה את העכבה.

פרוטוקול

1. מתאם בין ערכי CIT₅₀ לבין ריבוי זיהומים

1. הוסף 100 μL של מדיום תרבית סטרילי 1x MEM בכל באר של צלחת E. הכנס את לוחית ה-E לכיס העריסה של המכשיר בטמפרטורה של 35°C.
2. מדוד את הרקע כמתואר:
3. פתח את התוכנה.
   1. ב "הגדרת תבנית ניסוי המוגדרת כברירת מחדל", בחר את העריסות שנבחרו ולחץ פעמיים על העמוד העליון ולאחר מכן הזן את שם הניסוי. לחץ על "פריסה" והזן את המידע לדוגמה הדרוש עבור כל באר שנבחרה של הצלחת; לאחר מכן, לחץ על "החל" בסיום. לחץ על "תזמון" | "שלבים" | "הוסף שלב". התוכנה מוסיפה באופן אוטומטי צעד של 1s כדי למדוד את עכבת הרקע (CI).
   2. לחץ על "התחל/המשך" בכרטיסייה "ביצוע". לחץ על "מגרש", הוסף את כל הדגימות על ידי בחירת הבארות שהותאמו, וודא ש- CI הוא בין -0.1 ל- 0.1 לפני שתמשיך לשלב הבא.
4. הסר את צלחת ה- E מהעריסה.
5. זרעו 3 x 10⁴ של תאי MDCK טריים מפוצלים על כל באר של צלחת המיקרוטיטר האלקטרוני וגדלו אותם במשך 24 שעות ב 35 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ כך שהם נמצאים בשלב שכפול במהלך זיהום IAV.
6. להדביק תאי MDCK עם דילולים שונים פי 10 של טיטר ידוע 6log₁₀TCID₅₀/mL של וירוס H1N1, באמצעות פיפטינג הפוך לשחזור על ידי ביצוע השלבים הבאים:
   1. שטוף תאי MDCK 2x עם 100 μL של MEM ללא FCS (מדיה התפשטות וירוסים). שימו לב להסרת כל המדיה לאחר השטיפה השנייה כדי למנוע דילול נוסף של החיסון.
   2. הוסף 100 μL של תרחיף ויראלי בכל באר באמצעות פיפטה חד-ערוצית. כדי למנוע זיהום, המשך על ידי התחלה משמאל לימין, ולאחר מכן מלמעלה למטה בצלחת תוך כיסוי הבארות הנותרות עם המכסה.
   3. הכנס את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר בטמפרטורה של 35°C. היה עדין כדי למנוע תנועות פתאומיות שעלולות להוביל לזיהום.
   4. התחל לעקוב אחר עכבת התא כל 15 דקות במהלך לפחות 100 שעות כמתואר:
      1. הכנס את צלחת ה- E לכיס העריסה. לחץ על "תזמון" | "הוסף שלב" בתוכנה והזן ערכים לניטור תאים כל 30 דקות במשך 200 חזרות. לאחר מכן, בחר "התחל/המשך".
   5. לאחר שני מחזורי המדידות (כלומר, 30 דקות), השהה את המכשיר על ידי לחיצה על "השהה" בכרטיסייה "ביצוע" והסר את לוח E מהעריסה.
   6. הוסף 1μg/mL TPCK-טריפסין לאמצעי התפשטות הנגיף כדי לבקע את המגלוטינין הנגיפי.
   7. הוסף 100 μL של מדיה התפשטות וירוס המכיל TPCK-טריפסין לתוך כל באר ולהכניס את צלחת E לתוך כיס העריסה.
   8. לחץ על "התחל/המשך" בכרטיסייה "ביצוע".
      הערה: אל תשכח ליצור בקרה שלילית המתאימה לתאים נגועים מדומים על ידי החלפת השעיה ויראלית באמצעי התפשטות וירוסים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת E 16 (6 צלחות)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	לוחות אלקטרוניים זמינים באריזות שונות
MEM 1X	טכנולוגיות חיים (gibco)	31095029
TPCK-טריפסין	וורטינגטון	LS003740
xCELLigence מכשיר ניתוח תאים בזמן אמת S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	מכשירי xCELLigence RTCA S16 זמינים בפורמטים שונים (16-well, 96-well, יחיד או multi-plate)