בדיקת קינטיקה הישרדותית מבוססת עכבה תאית להערכת הישרדות הנגיף

תקציר

מקור: Labadie, T. et al., ניטור הישרדות נגיף השפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר טכניקה מבוססת עכבה תאית לחקר קינטיקה הישרדותית של וירוסים הגורמים להשפעות ציטופתיות. השיטה מודדת את העכבה החשמלית של תאים דבקים נגועים בנגיף שטופלו מראש במי מלח.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים וחומרי התחלה

1. הכנת תאי MDCK ומדיום תרבית תאים סטרילית
   1. טפחו תאי כליות כלבים Madin-Darby (MDCK) בתווך נשר מעובד (MEM) בתוספת 10% סרום עגל עובר מומת בחום (FCS) ואנטיביוטיקה (100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין).
   2. לאחר ההפשרה, יש לעבור את תאי MDCK לפחות פעמיים לפני הדבקתם כדי להבטיח החלמה מלאה (אך פחות מ-30 מעברים כדי למנוע סחף בפנוטיפים של התא).
   3. זרעים 75 ס"מ² צלוחיות תרבית רקמה המכילות 30 מ"ל סטרילי 1x MEM עם 7.5 x 10⁶ תאי MDCK ולדגור ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO₂.
2. הכנת ציוד ניטור עכבה
   1. הניחו את המכשיר באינקובטור בטמפרטורה של 35°C ואפשרו לו להתחמם למשך שעתיים לפחות.
   2. חברו אותו ליחידת הבקרה הממוקמת מחוץ לאינקובטור.
   3. המשך להליכי הניקוי כפי שהומלץ על ידי היצרן לפני תחילת שארית הניסוי.
3. ייצור מלאי IAV על תאי MDCK
   1. כדי להפיץ ולהגביר נגיפי H1N1, זרעו 7.5 x 10⁶ תאי MDCK על שני צלוחיות תרבית רקמה^{בגודל 75} ס"מ 2, ודגרו במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להגיע למפגש של 90%-100%.
   2. דקרו את מדיום תרבית התא מהמונושכבה של התא ב 75 ס"מ² צלוחיות. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של סטרילי 1x PBS.
   3. הסר PBS והוסף 5 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את התאים שוב.
   4. תייג בקבוק אחד כבקרה והסר PBS לפני הוספת 15 מ"ל של מדיה להפצת וירוסים (1x MEM עם 0% FCS) בזהירות על monolayer. לדגור על בקבוק זה באינקובטור הנשמר ב 35 ° C עם 5% CO₂. השתמש בו להשוואה לאחר 3 ימים של התפשטות.
   5. הפשיר בקבוקון אחד של מלאי IAV ב- RT. דלל את הנגיף לריכוז המתאים בצינור של 1.5 מ"ל המכיל מדיה להפצת וירוסים (1x MEM עם 0% FCS).
   6. הסר 1x PBS מהבקבוק^{בגודל 75} ס"מ 2 והדבק תאי MDCK בריבוי זיהומים (MOI) של 1 x ^10-3 או 1 x ^10-4 יחידות יוצרות פלאק לכל תא (pfu/ תא) על ידי הוספת 1 מ"ל של הנגיף המדולל למונושכבה של התא.
   7. לספוח וירוס לתאי MDCK במשך 45 דקות ב- RT על ידי ערבוב הבקבוק באופן קבוע כל 15 דקות.
   8. הסירו בעדינות את החיסון והוסיפו 15 מ"ל של אמצעי התפשטות וירוסים לכל בקבוק המכיל 1 מיקרוגרם/מ"ל TPCK-טריפסין (טריפסין/L-1-טוסילמיד-2- פנילאתיל כלורומתיל קטון), כדי לבקע את המגלוטינין הנגיפי HA0 לתת-יחידות HA1 ו-HA2 (אירוע הנדרש לאיחוי HA עם הממברנה האנדוזומלית ולשחרור הגנום הנגיפי).
   9. לדגור על צלוחיות ב 35 ° C ו 5% CO₂ לפחות במשך 3 ימים לפחות כדי לשכפל את הנגיף.
   10. התבוננו בתאי MDCK תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 וחפשו השפעות ציטופתיות (CPE) על התאים (על ידי השוואתם לצלוחית הבקרה של התא). אם CPE אינו שלם (כלומר, כ-80% מהתאים מנותקים מהמצע), החזירו את הצלוחיות לאינקובטור למשך 24 שעות נוספות.
   11. כאשר CPE הושלם, decant את supernatant תרבית התא ואת הצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות כדי להשליך את פסולת התא
   .
   12. העבר את הסופרנאטנט המזוקק לצינור של 15 מ"ל ונגיפי צאצאי aliquot לבקבוקונים קריוגניים סטריליים חד-פעמיים. מקם מיד את cryotubes ב -80 °C כדי להקפיא ומלאי וירוסים.
4. להדביק תאי MDCK עם דילולים שונים פי 10 של טיטר ידוע 6 log₁₀ TCID₅₀/mL של וירוס H1N1, באמצעות פיפטינג הפוך לשחזור על ידי ביצוע השלבים הבאים:
   1. שטוף תאי MDCK 2x עם 100 μL של MEM ללא FCS (מדיה התפשטות וירוסים). שימו לב להסרת כל המדיה לאחר השטיפה השנייה כדי למנוע דילול נוסף של החיסון.
   2. הוסף 100 μL של תרחיף ויראלי בכל באר באמצעות פיפטה חד-ערוצית. כדי למנוע זיהום, המשך על ידי התחלה משמאל לימין ואז מלמעלה למטה בצלחת תוך כיסוי הבארות הנותרות עם המכסה.
   3. הכנס את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר ב- 35 ° C. היה עדין כדי למנוע תנועות פתאומיות שעלולות להוביל לזיהום.
   4. התחל לנטר עכבת תאים כל 15 דקות במהלך 100 שעות לפחות כמתואר בשלב 2.10.
   5. לאחר שני מחזורי המדידות (כלומר, 30 דקות), השהה את המכשיר על ידי לחיצה על "השהה" בכרטיסייה "ביצוע" והסר את לוח E מהעריסה.
   6. הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל TPCK-טריפסין לאמצעי התפשטות הנגיף כדי לבקע את המגלוטינין הנגיפי.
   7. הוסף 100 μL של מדיה התפשטות וירוס המכיל TPCK-טריפסין לתוך כל באר ולהכניס את צלחת E לתוך כיס העריסה. 8. לחץ על "התחל/המשך" בכרטיסייה "ביצוע".
      הערה: אל תשכח ליצור בקרה שלילית המתאימה לתאים נגועים מדומים על ידי החלפת השעיה ויראלית באמצעי התפשטות וירוסים.

2. קינטיקה הישרדותית IAV

1. יש לחשוף את IAV למים מזוקקים מלוחים בטמפרטורה של 35°C ולבדוק את מידת ההדבקה שלהם לאורך זמן על ידי מדידת ירידה בעכבת התא.
   1. הכינו מים מזוקקים מלוחים על ידי הוספת NaCl לריכוז סופי של 35 גרם/ליטר במים מזוקקים. הוסף 900 μL של מים מלוחים לתוך 2 מ"ל cryotubes.
   2. הוסף 100 μL של מלאי נגיפי במים מלוחים ומקם את הקריובטור באינקובטור (35 ° C, 5% CO₂) למשך 1 שעות, 24 שעות או 48 שעות.
   3. זרע 100 μL (המכיל 3 x 10⁴) של תאי MDCK טריים מפוצלים על צלחת microtiter 16 באר ולגדול במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   4. להדביק תאים עם 100 μL של וירוסים חשופים (בעבר דילל 10x במדיה תרבית) באמצעות שיטת pipetting הפוך לשחזור על ידי חזרה על סעיף 1.4.
2. נטר את עכבת התא כל 15 דקות במשך 100 שעות לפחות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% טריפסין	תרמופישר	25200056
בקבוק תרבית רקמה 75 סמ"ר	בז	430641U
צלחת E 16 (6 צלחות)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	לוחות אלקטרוניים זמינים באריזות שונות
FCS	טכנולוגיות חיים (gibco)	10270-106
MEM 1X	טכנולוגיות חיים (gibco)	31095029
PBS 1X	טכנולוגיות חיים (gibco)	14040091
פניצילין-סטרפטומיצין	טכנולוגיות חיים (gibco)	11548876
TPCK-טריפסין	וורטינגטון	LS003740
xCELLigence מכשיר ניתוח תאים בזמן אמת S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	מכשירי xCELLigence RTCA S16 זמינים בפורמטים שונים (16-well, 96-well, יחיד או multi-plate