בדיקת חומרים תגובתיים חומצה תיוברביטורית להערכת עקה חמצונית בסרום אנושי

תקציר

מקור: Borges, C. R. et al., Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את בדיקת החומרים הריאקטיביים של חומצה תיוברביטורית (TBARS) להערכת עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית

1. בדיקת TBARS

הערה: לאחר הפעלת בדיקת TBARS, יש לסיים אותה ללא הפסקה.

1. קח כמה דוגמאות ותקנים צנטריפוגות ב 1500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, יש לשמור את שפופרות הזכוכית המכילות את הדגימות והתקנים בשפופרות זכוכית RT. לפי הצורך לצורך ניתוח מספר הדגימות ולתייג אותן בשמות הדגימות. לאחר מכן, הוסף 100 μL של כל דגימה מוכנה (ליזטים של תאי HepG2, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, סרום אנושי) לכל צינור זכוכית.
2. הוסף 200 μL של 8.1% SDS לכל דגימה ותקן וסובב בעדינות את צינור הזכוכית בתנועה סיבובית כדי לערבב את הדגימה.
3. הוסף 1.5 מ"ל של מאגר נתרן אצטט 3.5 M (pH = 4) לכל דגימה ותקן.
4. הוסף 1.5 מ"ל של מאגר נתרן אצטט 3.5 M (pH = 4) לכל דגימה ותקן.
5. הביאו את הנפח הסופי ל-4 מ"ל עבור כל דגימה ותקן על ידי הוספת 700 מיקרוליטר של מי DI.
6. יש לסגור היטב כל צינור זכוכית ולדגור בבלוק חימום המוגדר ל-95°C למשך שעה אחת. מכסים את צינורות הזכוכית ברדיד אלומיניום למניעת עיבוי בחלק העליון של הצינורות.
7. מוציאים את צינורות הזכוכית מגוש החימום ודגרים על קרח למשך 30 דקות.
8. דגימות צנטריפוגות ותקנים ב 1500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שמור את צינורות הזכוכית המכילים את הדגימות והתקנים ב- RT.
   הערה: שמירת הדגימות על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תגרום לדגימה או לתקן כולו לזרז.
9. מיד לאחר הצנטריפוגה, aliquot 150 μL של supernatant מכל צינור ומניחים לתוך באר נפרדת של צלחת 96 באר
.
10. הסר את כל הבועות מכל באר באמצעות קצה פיפטה.
    הערה: נוכחות של בועות תניב קריאות ספיגה לא עקביות, מה שיוביל לחוסר דיוק גבוה בבדיקה.
11. ספיגת קריאה ב-532 ננומטר. הפחת את קריאת הספיגה הממוצעת של הדגימות הריקות מכל קריאות הספיגה האחרות.
12. צור עקומה סטנדרטית על-ידי התוויית קריאות הספיגה החסרות הריקות ב- 532 ננומטר לעומת הריכוז הידוע של כל תקן. התאם את נקודות הנתונים באמצעות רגרסיה ליניארית. חישוב ריכוזי מדגם לא ידועים באמצעות המשוואה של קו הרגרסיה הליניארי המתקבל מהעקומה הסטנדרטית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1x PBS סטרילי pH 7.4 1 ליטר	VWR, פנסילווניה	101642--262	מגיב ליזה של התא
50 מ"ל צינור צנטריפוגה עצמאי	קורנינג, ניו יורק	CLS430897	חומר כללי
צלחת באר 96, לא מטופלת, שקופה, עם מכסה, לא סטרילית	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	למדידת ספיגה
Amicon Ultra-0.5 100 kD מכשיר מסנן ספין צנטריפוגלי	Fisher Scientific, NH	UFC510024	טיהור LDL
מכסים לצינורות זכוכית	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	עבור בדיקת TBARS
נחושת II כלוריד	סיגמה, מיזורי	222011-250ז	כדי לגרום לחמצון
צינורות תרבית, חד פעמיים, עם גימור מכסה בורג, זכוכית בורוסיליקט (13 x 100 מ"מ)	VWR, פנסילווניה	53283-800	עבור בדיקת TBARS
המדיום החיוני המינימלי של הנשר (EMEM)	ATCC, וירג'יניה	HB-8065	מדיה סלולרית HepG2
צינורות Eppendorf לנעילה בטוחה, 1.5 מ"ל	eppendorf , ניו יורק	22363204	חומר כללי
צינורות Eppendorf לנעילה בטוחה, 2.0 מ"ל	Genesee Sceitific , קליפורניה	22363352	חומר כללי
סרום בקר עוברי מקור ארה"ב	אומגה סיינטיפיק, קליפורניה	FB-11	לתרבית תאים
חומצה אצטית קרחונית	סיגמה, מיזורי	27225-1L-R	מגיב TBARS
קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	מגיב ליזה של התא
HEPES	סיגמה, מיזורי	H3375-250G	ממס LDL
חומצה הידרוכלורית (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	מגיב ליזה של התא
מקרא מיקרו 17 צנטריפוגה	Thermo Scientific, MA	75002431	חומר כללי
ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה, פלזמה אנושית	אתונה מחקר וטכנולוגיה, ג'ורג'יה	12-16-120412	אב טיפוס של מטריצה ביולוגית
חטיפי ערבוב מגנטיים, מתומן מבחר 6	VWR, פנסילווניה	58948-025	חומר כללי
Malondialdehyde bis (דימתיל אצטל)	סיגמה, מיזורי	8207560250	תקן TBARS
ספקטרופוטומטר Multiskan Go Microplate	Fisher Scientific, NH	51119200	למדידת ספיגה
NP-40	EMD Millipore Corp, מסצ'וסטס	492016-100 מ"ל	מגיב ליזה של התא
נתרן כלורי	סיגמה, מיזורי	S7653-1KG	מגיב ליזה של התא
סודיום דודציל סולפט (SDS)	סיגמה, מיזורי	436143-100 גרם	מגיב TBARS
נתרן הידרוקסידי	סיגמה, מיזורי	367176-2.5 ק"ג	מגיב TBARS
רכז SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	לריכוז ליזטים של תאים
חומצה תיוברביטורית	סיגמה, מיזורי	T5500-100G	מגיב TBARS
בסיס TRIS	Fluka , ג'ורג'יה	93362	מגיב ליזה של התא