בדיקת הנבטת כורואיד לחקר התפשטות כלי דם עיניים Ex Vivo

תקציר

מקור: Tomita, Y., et al. An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל ex vivo של הנבטה כורואידית לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית. הבדיקה כוללת תרבית של צמחי עין עכבר המכילים את רקמת הכורואיד המחוברת ללובן העין ולאפיתל פיגמנט הרשתית בתנאים ספציפיים המקדמים הנבטה מיקרו-וסקולרית כורואידית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנה

1. הוסף 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ו-5 מ"ל ו-10 מ"ל של תוספים הזמינים מסחרית ל-500 מ"ל של מדיום קלאסי מלא עם סרום. Aliquot 50 מ"ל של המדיום בתחילה.
   הערה: אין להחזיר שום מדיום בחזרה למלאי כדי למנוע זיהום.
2. שים aliquot של המדיום הקלאסי המלא על הקרח.
3. השתמשו באתנול 70% כדי לנקות את המיקרוסקופ, המלקחיים והמספריים המנתחים.
4. הכינו שתי מנות תרבית תאים (10 ס"מ), אחת במיקרוסקופ דיסקציה ואחת על קרח; שימו 10 מ"ל של מדיום קלאסי שלם בכל מנה.

2. שלבי ניסוי (איור 1)

1. יש להקריב עכברי C57BL/6J סביב הלידה (P) 20 באמצעות 75-100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-7.5-10 מ"ג/ק"ג קסילזין המוזרק תוך צפקית. יש לשמור את העיניים בתווך קלאסי מלא על קרח לפני נתיחה.
2. הסר את רקמת החיבור (שריר ורקמת שומן) ואת עצב הראייה על העין.
3. השתמש במיקרו-מספריים כדי לחתוך 0.5 מ"מ אחורי ללימבוס הקרנית. הסר את קומפלקס הקרנית/קשתית, הזגוגית והעדשה.
4. יש לבצע חתך בקוטר 1 מ"מ בניצב לקצה החתוך לכיוון עצב הראייה ולחתוך רצועה היקפית ברוחב 1 מ"מ. להפריד בין האזורים המרכזיים והפריפריאליים של המתחם. השתמש במלקחיים כדי לקלף את הרשתית מקומפלקס RPE/choroid/sclera.
5. שמור את רצועת הכורואיד ההיקפית בתווך קלאסי מלא על קרח; בודד את העין השנייה וחזור על התהליך כדי לחתוך רצועה שנייה.
6. חותכים את הרצועה המעגלית ל 6 ~ חתיכות מרובעות שוות (~ 1 מ"מ x 1 מ"מ).
   הערה: לעולם אל תיגע בשום קצה.
7. הפשירו את תמצית קרום הבסיס (BME) לפי הוראת היצרן. הוסף 30 μL / באר של BME למרכז כל באר של צלחת תרבית רקמה 24 באר. ודא שהטיפה של BME יוצרת כיפה קמורה בתחתית הצלחת מבלי לגעת בקצוות.
   הערה: הפשירו את ה-BME למשך הלילה במקרר. BME צריך להיות על הקרח בכל עת לאחר הפשרה.
8. מניחים את הרקמה באמצע BME.
   הערה: אין לשטח את explant כורואידים; בדרך כלל, תן לרקמה להתרחב בתוך BME. כיוון הרקמה (צד סקלרלי למעלה או למטה) אינו משפיע על תוצאת הניסוי.
9. לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 10 דקות כדי לתת את הג'ל להתמצק.
10. מוסיפים 500 μL של המדיום/באר הקלאסי השלם.
11. שנה את המדיום הקלאסי כל יומיים (500 μL). ניתן לצפות בהנבטת כורואידים לאחר 3 ימים במיקרוסקופ.
    הערה: לטיפול בגורם גדילה, להרעיב את הרקמה במשך 4 שעות. יש לדלל תרכובת ניסוי בתווך מופחת גורם גדילה (דחיפה של 1:200 במקום 1:50).

3. שיטת כימות ממוחשבת SWIFT-Choroid (איור 2)

הערה: נעשה שימוש בשיטה ממוחשבת למדידת השטח המכוסה על ידי כלי גידול. יש צורך בתוסף מאקרו לתוכנת ImageJ לפני הכימות.

1. פתח את תמונת הנבטת הכורואיד עם ImageJ וסמן "תמונה |סוג| 8 סיביות" עם גווני אפור.
2. עבור אל "תמונה | התאמה | בהירות/ניגודיות (Ctrl/shift/ C)" ומיטוב הניגודיות.
3. השתמשו בפונקציית שרביט הקסמים כדי לשרטט ולהסיר מהתמונה את רקמת הכורואיד שנמצאת במרכז הנבטים (באמצעות מקש קיצור "F1") (איור 2A, B).
   הערה: הגדר את שיעור הסובלנות של שרביט הקסמים ל 20-30%.
4. הסירו את רקע התמונה בעזרת כלי הבחירה החופשית (איור 2C). עבור אל "תמונה | התאמה | סף (Ctrl/shift/T)". השתמשו בפונקציית הסף כדי להגדיר את הנבטים המיקרו-וסקולריים על רקע ופריפריה (איור 2D).
5. לחץ על "F2" ויופיע סיכום. שמור תמונה של האזור שנבחר על ידי לחיצה על "שמור". שמור אותה באותה תיקייה שבה נמצאת התמונה המקורית לעיון עתידי.
6. לאחר מדידת קבוצת דגימות, העתק את הרשומה לניתוח נתונים.
   הערה: ניתן גם למדוד את השטח (μm²) על ידי "ניתוח | הגדר קנה מידה" באמצעות תמונות עם סרגלי קנה מידה.

תוצאות

איור 1: איור סכמטי המראה בדיקת הנבטת כורואידים.
העיניים נחשפו לראשונה ונחתכו באופן היקפי כ-0.5 מ"מ אחורי ללימבוס. הקרנית, הקשתית, העדשה והזגוגית הוסרו. לאחר מכן בוצע חתך של 1 מ"מ מקצה העין לכיוון עצב הראייה. לאחר מכן נחתכה רצועה כ-1.0 מ"מ אחורית לקצה החתוך והופרדו הרצועה והאזורים ההיקפיים של המכלול. הרצועה נחתכה לחתיכות בגודל של כ-1 מ"מ על 1 מ"מ והוטמעה ב-BME. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ, דמיינו את הנבטים המיקרו-וסקולריים מהכורו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AnaSed (קסילזין)	AKORN	59339-110-20
תמצית קרום בסיסי (BME) מטריג'ל	BD Biosciences	354230
צלחת תרבית תאים	קן	704001	10 ס"מ
מדיום קלאסי מלא עם סרום ו-CultureBoost	מערכות סלולריות	4Z0-500
אתיל אלכוהול 200 הוכחה	פארמקו	111000200	לשימוש עבור 70%
מגבונים	קימברלי-קלארק	06-666
מיקרוסקופ	ZEISS	Axio Observer Z1
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	15140	10000 U/מ"ל
צלחת תרבית רקמות (24-well)	אולימפוס	25-107
VetaKet CIII (קטמין)	AKORN	59399-114-10