בדיקת פעילות קולטן-מדווח אסטרוגן לבדיקת פעילות פיטואסטרוגן אסטרוגנית

תקציר

מקור: Fender, E. et al., Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר בדיקת כתב מבוססת תאים כדי לקבוע את הפעילות האסטרוגנית של תרכובות שמקורן בצמח. תרכובת בעלת פעילות דמוית אסטרוגן מחקה את קשירתה לקולטני אסטרוגן ומניעה שעתוק גנים של אנזים מדווח במורד הזרם. אנזים הכתב מייצר ביולומינסנציה בתגובה, המציינת את הפעילות האסטרוגנית של התרכובת.

פרוטוקול

1. קולטן אסטרוגן אנושי β בדיקת טרנספקציה

הערה: טכניקה אספטית ומכסה מנוע זרימה למינרית נדרשים ליום הראשון של פרוטוקול הבדיקה.

1. הכינו דילולים של 17β-אסטרדיול לעקומה הסטנדרטית.
   1. העבירו את מדיום שחזור התאים ואת מדיום ההקרנה המורכב (CSM) מאחסון המקפיא והפשירו אותם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
   2. תייגו צינורות מיקרוצנטריפוגות ביניים 1 ו-2 (INT1, INT2) ו-1-8.
   3. מלא INT1 עם 995 μL של CSM, INT2 עם 615 μL של CSM, צינור 1 עם 900 μL של CSM, ושפופרות 2-8 עם 600 μL של CSM. מניחים את הצינור 8 בצד.
   4. העבר 5 μL של 100 μM 17β-Estradiol Stock לתוך INT1. מחק את הטיפ. מערבולת.
   5. לפני כל העברה, שטפו את פיפטה 3 פעמים, ולאחר מכן העבירו 10 μL מ-INT1 ל-INT2. מחק את הטיפ.
   6. שטפו את פיפטה 3 פעמים, ולאחר מכן העבירו 100 μL מ-INT2 לצינור 1. יש להשליך טיפ. מעבירים 300 μL מצינור 1 לצינור 2. חזור על הפעולה עבור צינורות 3 עד 7. יש להשליך 300 μL מצינור 7 למיכל הפסולת. צינור 8 הוא אפס ואינו מקבל אסטרדיול. הריכוזים הסופיים של תקנים מצופים הם: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ו-0 pM אסטרדיול.
2. הכינו תרכובות לדוגמה.
   1. דגימות מערבולת.
   2. קח 4 μL מכל דגימת צמח ב- DMSO והוסף ל- 496 μL של CSM כדי להניב תמיסת DMSO של 0.8%.
3. הפשירו במהירות תאי כתב.
   1. אחזר את הצינור של Cell Recovery Medium מאמבט המים 37 °C. יש לחטא את המשטח החיצוני באמצעות אתנול 70%.
   2. אחזר תאי כתב מאחסון -80 °C והפשיר על ידי העברת 10 מ"ל של CRM שחומם מראש לצינור של תאים קפואים.
   3. סגרו את הצינור של תאי הכתב והעבירו אותם לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
   4. שלפו את הצינור של Reporter Cell Suspension מאמבט המים. הפוך את צינור התאים מספר פעמים בעדינות כדי לפרק אגרגטים של תאים ולייצר השעיה הומוגנית. נקה את פני השטח של הצינור עם 70% אתנול.
4. ציפוי Assay.
   1. יש לפזר 100 μL של תרחיף תא הכתב לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.
   2. יש לפזר 100 μL של דגימות בשילוש לבארות בדיקה מתאימות.
   3. מעבירים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס, לח 5% CO₂ אינקובטור במשך 22-24 שעות.
5. מצע לגילוי הפשרה וחיץ גילוי במקרר חשוך למשך הלילה כדי להתכונן ליום השני.
6. ממש לפני סיום הדגירה של הצלחת, מוציאים את מצע הגילוי ואת חיץ הגילוי מהמקרר ומניחים באזור תאורה חלשה עד לאיזון ל-RT. ברגע שאתה ב- RT, הפוך כל צינור בעדינות מספר פעמים כדי לערבב היטב תמיסות.
   1. מיד לפני השלמת הדגירה, שפכו את כל התוכן של מאגר הגילוי לתוך הצינור של מצע הגילוי כדי ליצור מגיב זיהוי לוציפראז. מערבבים בעדינות כדי לא לייצר קצף.
   2. לאחר השלמת הדגירה, הפכו את הצלחת כדי להשליך את התכולה למיכל פסולת מתאים. הקש בעדינות על הצלחת על מגבת נייר סופגת נקייה כדי להסיר את הטיפות האחרונות מהבארות.
   3. הוסף 100 μL של מגיב זיהוי Luciferase לכל באר. הניחו לצלחת הבדיקה לנוח ב-RT למשך 15 דקות. אין לנער את הצלחת.
7. כמת הארה באמצעות לומנומטר קורא לוחות 96 בארות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1000 מיקרוליטר פיפטה
20 μL פיפטה
200 מיקרוליטר פיפטה
אמבט מים 37°C
37 °C, אינקובטור 5% CO2 לח
70% אתנול
איזון אנליטי
מכסה מנוע זרימה למינרית בדירוג תרבית תאים
דימתיל סולפוקסיד
אגן מדיה חד פעמי, סטרילי
מערכת סינון טפטוף
צלוחיות ארלנמאייר			125 מ"ל ו 250 מ"ל
מתנול באיכות HPLC
מערכת בדיקת כתב ERβ אנושית, 1 x 96-well בפורמט assays	אינדיגו ביוסיינסז	IB00411	ערכת Assay - מנתחת 24 דוגמאות בתוספת עקומה סטנדרטית
ליופיליזר
פיפטה רב ערוצית
שייקר אורביטלי
לומנומטר קורא לוחות			לשעבר Bioteck Synergy HTX
מאייד סיבובי
צלוחיות תחתונות עגולות			50 מ"ל ו 300 מ"ל
צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים או אגני מדיה סטריליים רב ערוציים
טיפים סטריליים			200 μL ו- 1000 μL
מאמר Whatman כיתה 1
שקיות מערבולת			שקיות פוליאתילן סטריליות