העברת אנרגיית תהודה פורסטר שנפתרה בזמן לניטור זרחן חלבונים בתאים

תקציר

מקור: Padros, J. et al., מבחני העברת אנרגיה של Förster Resonance למדידת חלבוני STAT אנדוגניים פוספוריליים בתאים אנושיים. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את העברת אנרגיית התהודה של Förster שנפתרה בזמן או בדיקת TR-FRET כדי לקבוע זרחן חלבון אנדוגני בעזרת פלואורופורים של תורם ומקבל המתויגים על נוגדנים ספציפיים לחלבון בדיקה. טכניקה זו נועדה למדוד את הזרחן של חלבוני בדיקה בליזטים תאיים.

פרוטוקול

1. תרבית תאים

1. יש לשמור על תאים באינקובטור ובתרבית לחות של 37°C/5% CO₂ עם DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) (תאי HeLa ו-A431) או RPMI בתוספת 15% FBS (תאי U266B1). תרבית את התאים עד שהם מגיעים 70-80% מפגש, ולאחר מכן טריפסין אותם לעבור או להשתמש בהם עבור assays.
   הערה: מדיה תרבותית הכילה פנול אדום. לא בוצעה הרעבה בסרום לאף קו תאים לפני ביצוע הבדיקות.

2. טיטרציה של מגרה או מעכב באמצעות פרוטוקול בדיקת שתי לוחיות עם תאים דבקים

הערה: הליך זה מתאר כיצד לקבוע עוצמות ממריץ או מעכב על ידי יצירת עקומת ריכוז-תגובה מסדרת דילול של תרכובת הבדיקה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת מיקרו 96 באר, שקופה, תחתית שטוחה, פוליסטירן, מטופל בתרבית רקמות, סטרילי	קורנינג	3595	זוהי הצלחת לגידול תאים בעת שימוש בפרוטוקול בדיקת שתי צלחות. תרבית תאים אחרת 96-באר צלחות ניתן להשתמש
צלחת מיקרו 384 בארות, לבן, נפח נמוך	פרקיןאלמר	6007290	זוהי הצלחת לזיהוי TR-FRET בעת שימוש בפרוטוקולי הבדיקה של שתי או צלחת אחת. ניתן להשתמש בצלחות לבנות אחרות בעלות נפח נמוך של 384 בארות
קו תאים A431	ATCC	CRL-1555
אטם מיקרו-צלחת דביק	פרקיןאלמר	6050185
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	וויסנט	319-005-CL	THUNDER TR-FRET תואם למדיום תרבית המכיל פנול אדום
קורא לוחות EnVision Xcite Multilabel	פרקיןאלמר	2104-0020א	ניתן לבצע את הבדיקות על מגוון קוראי לוחות המצוידים באפשרות TR-FRET
קו תאי HeLa	ATCC	CCL-2
מכון הזיכרון רוזוול פארק 1640 בינוני (RPMI)	וויסנט	350-007-CL	THUNDER TR-FRET תואם למדיום תרבית המכיל פנול אדום
טריפסין/EDTA 0.05%	וויסנט	325-542-CL
מים טהורים במיוחד	נה	נה	השתמש במים בדרגת מילי-Q (18 MΩ.cm) כדי לדלל את חיץ הליזיס ואת חיץ הזיהוי