בדיקה מבוססת Luminescence להערכת רעילות עצבית של תרכובות בדיקה על נוירונים

תקציר

מקור: Wahlestedt, C., et al., A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה מבוססת לומינסנציה להערכת הרעילות העצבית של תרכובות מולקולות קטנות המקדמות צמיחה עצבית על יכולת הקיום של נוירונים שמקורם ב-hNPC. הבדיקה מודדת את רמת ה-ATP התוך-תאית, אינדיקטור לכדאיות התא, כדי להעריך רעילות עצבית לאחר טיפול בתרכובת בדיקה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית

1. בידוד ותרבית של תאי אב עצביים אנושיים (hNPCs)

1. הניחו את רקמת המוח בצלוחית פטרי בקוטר 100 מ"מ והסירו בזהירות את קרומי המוח באמצעות מלקחיים.
2. העבר את רקמת המוח לצינור חרוטי של 50 מ"ל ושטוף אותו פעמיים עם 20 מ"ל של PBS על ידי היפוך עדין של הצינור.
3. לדגור על רקמת המוח בצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל על ידי השקעת הרקמה בתמיסת דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים) ו- DNase I (10 U / mL) למשך 10 דקות ב- 37 ° C.
4. הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים עצבית (ראה טבלת חומרים) לצינור המכיל רקמת מוח ונתק מכנית את הנוירוספרות על ידי טריטוציה 20 עד 30 פעמים דרך קצה צינור של 1000 מיקרוליטר כדי ליצור תרחיף של תא יחיד.
5. סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר אשכולות תאים.
6. זרעו את התרחיף החד-תאי בבקבוק T-25 מאוורר עם 5-10 מ"ל של מדיום תרבית תאים עצבית בתוספת רכיבים המפורטים בטבלה 1.
   1. לעקר את תמיסת הפרין על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. תוסף B-27 ללא ויטמין A הוא תוסף ללא סרום לטיפוח אבות עצביים ותאי גזע מבלי לגרום להתמיינות.
      הערה: תאי אב עצביים אנושיים (hNPCs) מבודדים ממוח עוברי אנושי שנאסף מעובר שהופל. לאחר 7-10 ימים בתרבית, תאי גזע עצביים (NSCs) יוצרים מושבות נוירוספריות צפות בחופשיות, בעוד שסוגי תאים אחרים נשארים בתרחיף כתאים בודדים או נצמדים לתחתית הצלוחית. hNPCs מבודדים יכולים להיות בתרבית כמו נוירוספרות בהשעיה במשך מספר חודשים.

2. העברת hNPCs

1. אספו את המדיה המכילה את הכדורים הצפים, נוירוספרות גדולות וקטנות, והעבירו אותם לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
   הערה: מסיבות לא ידועות, העיתוי לפיצול הנוירוספרות משתנה בין 7 ימים ל -30 יום. עם זאת, בדרך כלל, נוירוספרות צריך לעבור כאשר הם מגיעים לקוטר גדול מ 700-900 מיקרומטר. זה כאשר מרכז הנוירוספירה מתחיל להחשיך, אשר נחשב סימן של שיעור גבוה של מוות תאי.
2. סובב את הנוירוספרות למטה על ידי צנטריפוגה ב 300-400 x גרם במשך 3 דקות.
3. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט ולאחר מכן השקיעו את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים מופשרים (ראו טבלת חומרים).
   1. הפוך aliquots של מגיב דיסוציאציה התא על ידי הוספת 500 μL לכל 1.5 מ"ל microtubes ולאחסן ב -20 ° C. כדי להימנע מאיבוד פעילות האנזים, הפשירו את מגיב הדיסוציאציה התאית על ידי החזקתו ב-RT או חממו במשך 5 דקות באמבט מים/חרוזים בטמפרטורה של 37°C.
4. בהתאם לצפיפות ולגודל הכדורים, לדגור על הכדורים השקועים ב 37 ° C במשך 5-15 דקות.
5. הוסף 5-10 מ"ל של מדיה תרבית מחוממת מראש לנוירוספרות המכילות 50 מ"ל צינור חרוטי וצנטריפוגה ב 300-400 x גרם במשך 5 דקות כדי לשקוע את הנוירוספרות.
6. שאפו את הסופרנאטנט והפיפט בעדינות למעלה ולמטה, באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, ב-2 מ"ל של מדיה תרבותית עד שכל הנוירוספרות נמצאות בתרחיף חד-תאי.
   הערה: הדיסוציאציה תהיה גלויה לעין בלתי. לפני הדיסוציאציה, הנוירוספרות הן בצורה של ספירות. לאחר טבילה במגיב דיסוציאציה ועל ידי פיפטציה למעלה ולמטה, הם יהפכו לתאים בודדים.
   1. ספרו ולוחמו את התאים הבודדים, 2 עד 3 מיליון תאים לכל צלוחיות T-25, ב-10 מ"ל של תרבית.
7. האכילו את התאים כל 3 ימים על ידי החלפת מחצית מאמצעי התרבית.
   1. ליישב נוירוספרות על ידי השענת הבקבוק כך שהוא בפינה התחתונה שלה. החזיקו את הבקבוק בתנוחה במשך כ-1-2 דקות עד למשקעים הנוירוספריים. לאחר מכן יש לשאוף חצי מהמדיה בעדינות על ידי החדרת פיפטה סרולוגית במדיה מעל הנוירוספרות המיושבות. תאים מנותקים יכולים להצטבר וליצור כדורים לאחר 2 עד 3 ימים בתרבית.

3. הקפאת hNPCs

1. הכינו את מדיום הקפאת התאים על ידי הוספת DMSO למדיית התרבית לריכוז סופי של 10% (v/v) או השתמשו באמצעי שימור קריוגני זמין מסחרית עבור סוגי תאים רגישים (ראו טבלת חומרים).
2. מיין כדורים גדולים על ידי העברת המדיה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולתת לכדורים לשקוע על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן להסיר ולהעביר את הנוירוספרות הגדולות לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל עבור עובר באמצעות 200 או 1000 μL pipet tip.
   הערה: נוירוספרות בקוטר גדול מ-900 מיקרומטר נחשבות לגדולות, ואלה שקוטרן קטן מ-500 מיקרומטר נחשבות קטנות.
3. סובב את שאר הנוירוספרות כלפי מטה באמצעות צנטריפוגה במהירות של 300-400 x גרם למשך 3 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט.
4. להשהות עד 100 כדורים ב 1 מ"ל של מגיב cryopreservation ולהעביר אותו cryotube.
5. יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C במיכל הקפאת תאים (ראו טבלת חומרים) ולהעביר אותו לחנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך.
   הערה: עדיף להקפיא נוירוספרות קטנות עד בינוניות (בקוטר הנמוך מ-900 מיקרומטר) ולהימנע מהקפאת נוירוספרות גדולות (בקוטר של יותר מ-900 מיקרומטר) או בתאים בודדים. על מנת להפחית את הנזק לתאים בעת הפשרת הדגימה, שמרו על התאים צפופים על ידי זריעת הנוירוספרות המופשרות לתוך בקבוק T25 קטן.

4. הערכת רעילות עצבית

הערה: ציטוטוקסיות של תרכובות בדיקה מוערכת בלוחות של 384 בארות (ראה טבלת חומרים) באמצעות בדיקת כדאיות התא הזוהר (ראה טבלת חומרים). hNPCs מוכנים באותה שיטה, למעט שינויים קלים, המתוארים בסעיף "הבחנה וטיפול של hNPCs". לאחר מכן, אות זוהר שנוצר על ידי בדיקת כדאיות התא הזוהר נמדד באמצעות קורא microplate. האות הזוהר פרופורציונלי לריכוז ה-ATP התאי, שהוא עצמו ביחס ישר למספר התאים הקיימים בכל באר.

1. ציפוי
   1. הוסף 30 μL של poly-L-lysine (PLL) לכל באר של צלחת 384 באר.
   2. דגירה במשך שעה אחת ב- RT.
   3. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
   4. תן לו להתייבש ב RT (במשך כ 30 דקות).
   5. הוסף 30 μL של למינין (50 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר של צלחת 384 באר.
   6. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
   7. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
      הערה: צלחות מצופות 384-באר ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך חודש אחד.
2. ציפוי התאים
   1. ספירה וצלחת 20,000 נוירוספרות חד-תאיות לכל באר של צלחת 384 בארות ב-25 מיקרוליטר של אמצעי התמיינות.
   2. לדגור במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
   3. לאחר 5 ימים, יש לטפל בתאים במשך 24 שעות על ידי תרכובות בדיקה שהוכנו בריכוז הרצוי פי 6 בנפח 5 μL (כדי להגיע לנפח הסופי של 30 μL לכל באר).
3. בדיקת כדאיות התא
   1. הוסף 30 μL של מגיב בדיקת כדאיות התא הזוהר לכל באר של צלחת 384 באר.
      הערה: הוסף נפח של מגיב בדיקת כדאיות התא הזוהר השווה לנפח הקיים בכל באר. הפשיר את מגיב בדיקת הכדאיות של התא הזוהר ואזן אותו ל- RT לפני השימוש.
   2. נערו על שייקר במשך 2 דקות (כדי לערבב ולגרום לליזה של התא).
   3. סובבו את התערובת על ידי צנטריפוגה ב 300-400 x גרם במשך 30 שניות.
   4. דגור על צלחת 384 בארות במשך 10 דקות ב- RT במקום מוגן מפני אור (כדי לייצב את האות הזוהר).
   5. הקלט עוצמת אור באמצעות קורא microplate.
      הערה: השתמש בבקרות מתאימות לבדיקת הכדאיות, כולל Velcade (בריכוז סופי של 10 μM) כחיובי ו- HBSS המכיל DMSO (עם ריכוז סופי של 0.1% או 0.2%) כבקרה השלילית.

טבלה 1. רכיבים הדרושים לייצור 100 מ"ל של מדיה תרבותית

כמות	רכיב
100 מיקרוליטר	EGF (20 ננוגרם/מ"ל)
100 מיקרוליטר	FGF (10 ננוגרם/מ"ל)
2 מ"ל	B-27, מינוס ויטמין A (50X)
1 מ"ל	L-אלניל-L-גלוטמין (100X) (ראו טבלת חומרים)
4 μL	הפרין (2 מיקרוגרם/מ"ל)
96.8 מ"ל	מדיום תרבית תאים עצבית (ראה טבלת חומרים)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית	גיבקו	15240062
B27	תרמו	17504001
B27 - מינוס ויטמין A	תרמו	12587010
BDNF	פפרוטק	450-02
BSA	סיגמא	A8531
CellTiter-Glo	פרומגה	G7572
CoolCell	קורנינג	432000	מיכלי הקפאת תאים המבטיחים קצב מתוקנן ומבוקר של -1°C/דקה הקפאת תאים במקפיא של -80°C
CryoStor CS10	טכנולוגיות StemCell	7930	אמצעי שימור בהקפאה המכיל 10% DMSO
DMEM/F12	גיבקו	11320033
DMSO	סיגמא	34869-100 מ"ל
EGF	גיבקו	PHG0311
FGF	גיבקו	PHG6015
GDNF	פפרוטק	450-10
גלוטמקס	גיבקו	35050061	תוסף L-alanyl-L-גלוטמין
הפארין	קלביוכם	375095
למינין	סיגמא	L2020-1MG
L-חומצה אסקורבית	סיגמא	A92902-25G
mFreSR	טכנולוגיות StemCell	5854	מדיום שימור קריופטנטי ללא סרום המיועד לשימור בהקפאה של תאי גזע עובריים אנושיים ופלוריפוטנטיים מושרים
N2	גיבקו	17502048
Nunc 384-באר פוליסטירן לבן microplates	תרמו	164610
PBS	תרמו	10010-049
פולי-ל-ליזין	סיגמא	P5899-5MG
StemPro Accutase	גיבקו	A1110501	מגיב דיסוציאציה של תאים המכיל אנזימים מפרקי חלבון וקולגנוליטים
מדיום נוירובזלי	גיבקו	21103049