בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

Abstract

מקור: Wiertelak, W. et.al., הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני ממברנה מסוג III תושבי Golgi באמצעות Split Luciferase Complementation Assay. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

Protocol

1. טרנספקציה חולפת של הביטוי פלסמידים לתוך התאים

1. קצרו את תרבית התאים HEK293T הדבקה על ידי טריפסיניזציה והשהו מחדש את התאים במדיום גידול שלם ייעודי. לוחים את התאים (2 x 10⁴/100 μL/well) על צלחת תחתונה שקופה, צד לבן 96 באר. התאם את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והבקרות שנבדקו כולל replicates.
   הערה: נסו להשתמש רק ב-60 הבארות הפנימיות של הצלחת כדי למזער את השינויים התרמיים ולהימנע מאידוי בן לילה. מומלץ מאוד להשתמש בצלחות מצופות פולי-D-ליזין כמו אלה המצוינות בטבלת החומרים, אחרת התאים עלולים להתנתק במהלך שלבי הכביסה הבאים.
2. תרבית את התאים לילה בתנאים סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO₂).
3. למחרת transfect התאים עם שילובים הרצויים של פלסמידים ביטוי.
   1. יש לדלל פלסמידים בעלי ביטוי בתווך נטול סרום (ראו טבלת חומרים) ל-6.25 ננוגרם/מיקרוליטר לכל מבנה.
   2. יש להוסיף את מגיב הטרנספקציה מבוסס השומנים ביחס ליפיד לדנ"א מתאים ולדגור בהתאם להוראות היצרן.
   3. הוסף 8 μL של שומנים: תערובת DNA לבארות ייעודיות. מערבבים את תוכן הצלחת בסיבוב עדין. התוצאה היא טרנספקציה של שני מבני הביטוי ב-50 ננוגרם/באר.
4. תרבית את התאים במשך 20-24 שעות בתנאים סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO₂).
   הערה: גידול התאים למשך זמן רב יותר עשוי לגרום לרמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון היתוך, אשר עשוי לקדם קשר לא ספציפי בין המקטעים.

2. חליפין בינוני

1. למחרת להחליף את המדיום המותנה עם 100 μL של מדיום ללא סרום בכל באר. ודא שהתאים לא התנתקו בחילוף בינוני.
   הערה: שלב זה צריך להיעשות 2-3 שעות לפני תוספת של פתרון עבודה furimazine. נסיגה בסרום ממזערת את הרקע הנגרם על ידי הארה אוטומטית של furimazine.

3. הכנת פתרון עבודה furimazine

1. רגע לפני המדידה, מערבבים נפח אחד של פורימזין עם 19 נפחים של חיץ דילול (דילול של פי 20).
   הערה: הנפח הכולל של פתרון העבודה furimazine להיות מוכן תלוי במספר בארות בודדות להיות מנותח (פתרון עבודה furimazine מתווסף למדיום תרבית התא ביחס של 1: 5, ולכן, לכל באר מלאה בעבר עם 100 μL של מדיום ללא סרום 25 μL של פתרון עבודה furimazine יש להוסיף).
2. הוסף את פתרון העבודה furimazine לבארות ייעודיות (25 μL / באר). ערבבו בעדינות את הצלחת ביד או באמצעות שייקר אורביטלי (למשל, 15 שניות ב-300-500 סל"ד).

4. מדידת הארה

1. הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-לוחות זוהר.
   1. עבור ניסויים שיש לבצע ב 37 ° C לאזן את הצלחת במשך 10-15 דקות בטמפרטורה המצוינת.
2. בחר את הבארות לניתוח.
3. עוצמת האור של קריאה עם זמן שילוב של 0.3 שניות. המשך לנטר עוצמת אור למשך עד שעתיים בעת הצורך.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% תמיסת טריפסין-EDTA			תרבית תאים
קו תאי יונקים דבקים			תרבית תאים
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well לבן/שקוף תחתון שטוח מטופל TC Microplate, עם מכסה	קורנינג	356651	כלי פלסטיק
צנטריפוגת תרבית תאים			כלי פלסטיק
תוספי תרביות תאים (סרום בקר עוברי מומת חום, L-גלוטמין, פניצילין, סטרפטומיצין)			תרבית תאים
אינקובטור CO2			מכשיר
פלסמידים בעלי ביטוי המקודדים חלבונים בעלי עניין שאינם מתויגים עם מקטעי NanoBiT			בדיקת מעבדה
מגיב טרנספקציה HD FuGENE	פרומגה	E2311	בדיקת מעבדה
GloMax Discover Microplate Reader (או קורא מיקרו-צלחות זוהר אחר)	פרומגה	GM3000	מכשיר
מדיום גידול המוקדש לקו התאים המשמש			תרבית תאים
חומרים וריאגנטים לשיבוט מולקולרי סטנדרטי (חיידקים, פולימראז תרמויציב, אנזימי הגבלה, ליגאז DNA, חומרים וריאגנטים לטיהור חומצות גרעין)			בדיקת מעבדה
מערכת NanoBiT MCS Starter	פרומגה	N2014	ערכה זו מכילה וקטורים המאפשרים תיוג של החלבונים המעניינים עם מקטעי NanoBiT בכיוונים שונים, כמו גם פלסמיד הבקרה המקודד חלבון HaloTag המאוחה עם SmBiT וזוג פלסמיד בקרה חיובי.
מערכת בדיקת תאים חיים Nano-Glo	פרומגה	N2011	ערכה זו מכילה furimazine, שהוא מצע המאפשר זיהוי פעילות NanoLuc בתאים חיים, וחיץ דילול ייעודי.
Opti-MEM I סרום מופחת בינוני, ללא פנול אדום	גיבקו	11058021	תרבית תאים
שייקר אורביטלי			מכשיר