$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. פרוטוקול MeCP2-ECLIA
- הכנת תמיסת כביסה, חיץ חוסם ותמיסת דילול בדיקה (יום 1)
- הוסף 500 μL של Tween 20 עד 1 L של PBS כדי להכין 0.05% Tween 20 בתמיסת PBS, לערבב במרץ ולתייג כ"תמיסת כביסה".
הערה: ודאו שנעשה שימוש רק במאגר כביסה טרי.
- הכינו תמיסת חסימה של חוסם A (טבלת חומרים) 3% במי מלח חוצצי פוספט (PBS). מערבבים על ידי ערבוב עדין, מסננים, מעקרים ושומרים במקרר עד לשימוש למשך שבועיים לכל היותר.
- הוסף 5 מ"ל של פתרון חסימה ל -10 מ"ל של PBS כדי להכין פתרון מדלל בדיקה (1% חוסם A ב- PBS).
- ציפוי של לוחות קשירה גבוהה
- הוציאו לוח קשירה גבוה בעל 96 מערכים מרובי מערכים חד-נקודתיים.
הערה: ללוחות קשירה גבוהים יש יכולת קשירה גדולה יותר ולכן טווח דינמי גדול יותר מאשר לוחות סטנדרטיים עם משטחים הידרופוביים.
- הפשירו את נוגדן העכבר החד-שבטי נגד MeCP2 על קרח וערבבו 0.67 מיקרוליטר של הנוגדן עם 4 מ"ל של PBS (דילול נוגדנים בקנ"מ 1:6,000 ב-PBS). מערבלים את תמיסת הנוגדנים כדי לערבב היטב ולתייג את הצינור כ"תמיסת ציפוי".
- בזהירות לוותר 25 μL של פתרון ציפוי בפינה התחתונה של כל באר באמצעות pipettor רב ערוצי; זה נקרא שיטת ציפוי תמיסה. טפחו בעדינות על צלחת 96 הבארות מכל צד כדי להבטיח שתמיסת הציפוי מכסה את תחתית כל באר.
- אוטמים את הצלחת בנייר כסף דביק ודוגרים על הצלחת במקרר ב-4°C למשך הלילה (12-16 שעות).
- חסימה (יום 2)
- מוציאים את הצלחת מהמקרר ומסירים את נייר הכסף.
- הסר את תמיסת ציפוי הנוגדנים על ידי הכנסתה לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל תמיסת הציפוי מהבארות.
- הוסף 125 μL של פתרון חסימה לכל באר. אטמו שוב את הצלחת והניחו אותה על שייקר מיקרו-צלחת מסלולי.
- דוגרים על הצלחת במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות קבועות ב-800 סל"ד.
- הכנת תקנים ודוגמאות
- במהלך הדגירה, הכינו את תקני החלבון MeCP2 ו/או TAT-MeCP2 ודגימות שונות.
הערה: חיץ ליזיס המשמש לדילול סטנדרטי חייב להיות זהה לזה המשמש בדגימות שנותחו.
- הוציאו בקבוקון אחד של MePC2 ו/או תמיסת מלאי חלבונים TAT-MeCP2 (250 מיקרוגרם/מ"ל), ליזטים במוח עכבר וליזאטים HDF מ-80°C-. הפשירו אותם על קרח.
- דללו את תמיסת המלאי הסטנדרטית (MeCP2 ו/או TAT-MeCP2) בצינורות נקיים לפי טבלה 1.
- דללו את הדגימות במאגר הליזה באופן הבא: 1-20 מיקרוגרם של ליזט מוח עכבר לכל 25 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, ו-0.25-1 מיקרוגרם של HDF lysate לכל 25 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. הכן נפח מספיק של כל מדגם כדי לבצע ניתוח משולש.
- הוספת דוגמאות ופתרונות סטנדרטיים
- הסר את פתרון החסימה על ידי הכנסתו לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון החסימה מהבארות.
- שטפו את הצלחת 3x עם 150 מיקרוליטר של תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה המיידית.
- הוסף 25 ul של תקנים ודוגמאות לפינה התחתונה של הבאר באמצעות פיפטה חד-ערוצית.
- אוטמים את הצלחת ודגרים על הצלחת למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטול מתמיד ב-800 סל"ד.
- נוגדן זיהוי ללא תווית
- הפשירו את נוגדן הארנב הרב-שבטי נגד MeCP2 על קרח. לדלל את הנוגדן 1:6,000 בתמיסה מדללת בדיקה.
- הסר את התקנים והדגימות על ידי הכנסתם לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר.
- שטפו את הצלחת 3x עם 150 מיקרוליטר של תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה המיידית.
- הוסף 25 μL של נוגדן זיהוי לא מסומן לכל באר עם pipettor רב ערוצי. אטמו את הצלחת ודגרו עליה למשך שעה אחת עם טלטול מתמיד ב-800 סל"ד בטמפרטורת החדר.
- נוגדן מצומד ספציפי
- מוציאים את הנוגדן המשני הספציפי (טבלת חומרים) מהמקרר ומניחים אותו על קרח. יש לדלל את הנוגדן 1:666.67 בתמיסת מדלל בדיקה ולערבב בעדינות.
- הסר את הנוגדן המשני החופשי ללא תווית על ידי הכנסתו לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר.
- שטפו את הצלחת 3x עם 150 מיקרוליטר של תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה המיידית.
- הוסף 25 μL של נוגדן מצומד ספציפי (טבלה של חומרים) לכל באר עם pipettor רב ערוצי. אטמו את הצלחת ודגרו במשך שעה אחת עם טלטול מתמיד ב-800 סל"ד בטמפרטורת החדר.
- קריאת הצלחת
- הסר את הנוגדן המצומד החופשי (טבלה של חומרים) על ידי הכנסתו לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר.
- שטפו את הצלחת 3x עם 150 μL של תמיסת כביסה.
- הוסף 150 μL של 1x Tris-based Gold read buffer (Table of Materials) עם חומר פעיל שטח המכיל טריפרופילאמין כמגיב משותף ליצירת אור לצלחת. הימנע מבועות אוויר באמצעות טכניקות פיפטינג הפוך.
- הניחו את הצלחת על פלטפורמת זיהוי המיקרו-צלחות (Table of Materials) והתחילו מיד במדידה. השתמש בהגדרות עבור רכישת צלחת 96 בארות.
- לכוד את אותות האלקטרוכימילומינסנציה באמצעות מצלמת CCD מובנית במערכת זיהוי אלקטרוכימילומינסנציה (רשימת חומרים) והקלט את ספירות האותות, התואמות ליחידות אור יחסיות (RLU) ועומדות ביחס ישר לעוצמת האור.
הערה: בעת גירוי אלקטרוכימי, תווית הרותניום הקשורה לאלקטרודת הפחמן פולטת אור זוהר ב-620 ננומטר. נתח נתונים באמצעות התוכנה הנלווית למכשיר (Table of Materials).
טבלה 1: סדרות סטנדרטיות מ-0 עד 1,800 ננוגרם/מ"ל.
| תקן | ריכוז | דילול |
| חדר סטנדרט 1 | 1,800 ננוגרם/מ"ל | 1.08 μL תמיסת מלאי סטנדרטית + 148.92 מיקרוליטר חיץ ליזיס |
| חדר סטנדרט 2 | 600 נ"ג/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 1 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 3 | 200 ננוגרם/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 2 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 4 | 66.67 ננוגרם/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 3 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 5 | 22.22 ננוגרם/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 4 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 6 | 7.41 נ"ג/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 5 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 7 | 2.47 נ"ג/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 6 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 8 | 0.82 נ"ג/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 7 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 9 | 0.27 נ"ג/מ"ל | 50 μL חיץ ליזיס סטנדרטי 8 + 100 μL |
| חדר סטנדרט 10 | 0 נ"ג/מ"ל | 150 μL חיץ ליזיס |