בדיקת אלקטרוכימילומינסנציה לכימות רמות חלבון המטרה בליזט במוח

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE

1. פרוטוקול MeCP2-ECLIA

1. הכנת תמיסת כביסה, חיץ חוסם ותמיסת דילול בדיקה (יום 1)
   1. הוסף 500 μL של Tween 20 עד 1 L של PBS כדי להכין 0.05% Tween 20 בתמיסת PBS, לערבב במרץ ולתייג כ"תמיסת כביסה".
      הערה: ודאו שנעשה שימוש רק במאגר כביסה טרי.
   2. הכינו תמיסת חסימה של חוסם A (טבלת חומרים) 3% במי מלח חוצצי פוספט (PBS). מערבבים על ידי ערבוב עדין, מסננים, מעקרים ושומרים במקרר עד לשימוש למשך שבועיים לכל היותר.
   3. הוסף 5 מ"ל של פתרון חסימה ל -10 מ"ל של PBS כדי להכין פתרון מדלל בדיקה (1% חוסם A ב- PBS).
2. ציפוי של לוחות קשירה גבוהה
   1. הוציאו לוח קשירה גבוה בעל 96 מערכים מרובי מערכים חד-נקודתיים.
      הערה: ללוחות קשירה גבוהים יש יכולת קשירה גדולה יותר ולכן טווח דינמי גדול יותר מאשר לוחות סטנדרטיים עם משטחים הידרופוביים.
   2. הפשירו את נוגדן העכבר החד-שבטי נגד MeCP2 על קרח וערבבו 0.67 מיקרוליטר של הנוגדן עם 4 מ"ל של PBS (דילול נוגדנים בקנ"מ 1:6,000 ב-PBS). מערבלים את תמיסת הנוגדנים כדי לערבב היטב ולתייג את הצינור כ"תמיסת ציפוי".
   3. בזהירות לוותר 25 μL של פתרון ציפוי בפינה התחתונה של כל באר באמצעות pipettor רב ערוצי; זה נקרא שיטת ציפוי תמיסה. טפחו בעדינות על צלחת 96 הבארות מכל צד כדי להבטיח שתמיסת הציפוי מכסה את תחתית כל באר.
   4. אוטמים את הצלחת בנייר כסף דביק ודוגרים על הצלחת במקרר ב-4°C למשך הלילה (12-16 שעות).
3. חסימה (יום 2)
   1. מוציאים את הצלחת מהמקרר ומסירים את נייר הכסף.
   2. הסר את תמיסת ציפוי הנוגדנים על ידי הכנסתה לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל תמיסת הציפוי מהבארות.
   3. הוסף 125 μL של פתרון חסימה לכל באר. אטמו שוב את הצלחת והניחו אותה על שייקר מיקרו-צלחת מסלולי.
   4. דוגרים על הצלחת במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות קבועות ב-800 סל"ד.
4. הכנת תקנים ודוגמאות
   1. במהלך הדגירה, הכינו את תקני החלבון MeCP2 ו/או TAT-MeCP2 ודגימות שונות.
      הערה: חיץ ליזיס המשמש לדילול סטנדרטי חייב להיות זהה לזה המשמש בדגימות שנותחו.
   2. הוציאו בקבוקון אחד של MePC2 ו/או תמיסת מלאי חלבונים TAT-MeCP2 (250 מיקרוגרם/מ"ל), ליזטים במוח עכבר וליזאטים HDF מ-80°C-. הפשירו אותם על קרח.
   3. דללו את תמיסת המלאי הסטנדרטית (MeCP2 ו/או TAT-MeCP2) בצינורות נקיים לפי טבלה 1.
   4. דללו את הדגימות במאגר הליזה באופן הבא: 1-20 מיקרוגרם של ליזט מוח עכבר לכל 25 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, ו-0.25-1 מיקרוגרם של HDF lysate לכל 25 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. הכן נפח מספיק של כל מדגם כדי לבצע ניתוח משולש.
5. הוספת דוגמאות ופתרונות סטנדרטיים
   1. הסר את פתרון החסימה על ידי הכנסתו לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון החסימה מהבארות.
   2. שטפו את הצלחת 3x עם 150 מיקרוליטר של תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה המיידית.
   3. הוסף 25 ul של תקנים ודוגמאות לפינה התחתונה של הבאר באמצעות פיפטה חד-ערוצית.
   4. אוטמים את הצלחת ודגרים על הצלחת למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטול מתמיד ב-800 סל"ד.
6. נוגדן זיהוי ללא תווית
   1. הפשירו את נוגדן הארנב הרב-שבטי נגד MeCP2 על קרח. לדלל את הנוגדן 1:6,000 בתמיסה מדללת בדיקה.
   2. הסר את התקנים והדגימות על ידי הכנסתם לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר.
   3. שטפו את הצלחת 3x עם 150 מיקרוליטר של תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה המיידית.
   4. הוסף 25 μL של נוגדן זיהוי לא מסומן לכל באר עם pipettor רב ערוצי. אטמו את הצלחת ודגרו עליה למשך שעה אחת עם טלטול מתמיד ב-800 סל"ד בטמפרטורת החדר.
7. נוגדן מצומד ספציפי
   1. מוציאים את הנוגדן המשני הספציפי (טבלת חומרים) מהמקרר ומניחים אותו על קרח. יש לדלל את הנוגדן 1:666.67 בתמיסת מדלל בדיקה ולערבב בעדינות.
   2. הסר את הנוגדן המשני החופשי ללא תווית על ידי הכנסתו לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר.
   3. שטפו את הצלחת 3x עם 150 מיקרוליטר של תמיסת כביסה על ידי הוספת תמיסת הכביסה והסרתה המיידית.
   4. הוסף 25 μL של נוגדן מצומד ספציפי (טבלה של חומרים) לכל באר עם pipettor רב ערוצי. אטמו את הצלחת ודגרו במשך שעה אחת עם טלטול מתמיד ב-800 סל"ד בטמפרטורת החדר.
8. קריאת הצלחת
   1. הסר את הנוגדן המצומד החופשי (טבלה של חומרים) על ידי הכנסתו לסל האשפה והקש על הצלחת על מגבת נייר.
   2. שטפו את הצלחת 3x עם 150 μL של תמיסת כביסה.
   3. הוסף 150 μL של 1x Tris-based Gold read buffer (Table of Materials) עם חומר פעיל שטח המכיל טריפרופילאמין כמגיב משותף ליצירת אור לצלחת. הימנע מבועות אוויר באמצעות טכניקות פיפטינג הפוך.
   4. הניחו את הצלחת על פלטפורמת זיהוי המיקרו-צלחות (Table of Materials) והתחילו מיד במדידה. השתמש בהגדרות עבור רכישת צלחת 96 בארות.
   5. לכוד את אותות האלקטרוכימילומינסנציה באמצעות מצלמת CCD מובנית במערכת זיהוי אלקטרוכימילומינסנציה (רשימת חומרים) והקלט את ספירות האותות, התואמות ליחידות אור יחסיות (RLU) ועומדות ביחס ישר לעוצמת האור.
      הערה: בעת גירוי אלקטרוכימי, תווית הרותניום הקשורה לאלקטרודת הפחמן פולטת אור זוהר ב-620 ננומטר. נתח נתונים באמצעות התוכנה הנלווית למכשיר (Table of Materials).

טבלה 1: סדרות סטנדרטיות מ-0 עד 1,800 ננוגרם/מ"ל.