$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: מתכונים עבור הפתרונות והמאגרים הדרושים לפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 1.
1. כתם נקודה
- הכנת תקני DNA פלסמיד
- לדלל DNA פלסמיד גנום וקטורי AAV ל 10 ng/μL במים או חיץ Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). קח 25 μL של דילול זה ולעכל עם אנזים הגבלה מתאים במשך 1 שעה כדי ליניאריזציה של DNA פלסמיד בנפח תגובה של 50 μL.
הערה: אנחנו עושים קבוצה משוכפלת של עיכול (ראה שלב 1.4.1). האנזים המתאים צריך להיות כזה שחותך את הדנ"א של פלסמיד מחוץ לאזור קשירת כתם הנקודות. לנוחות, DNA פלסמיד מדולל יכול להיות aliquoted (25 μL / צינור) ומאוחסן קפוא ב -20 ° C לשימוש עתידי. לעכל את הדנ"א פלסמיד בזמן שהצינורות רועדים בשלב 5.1. אין לעכל יתר על המידה את תקן הדנ"א של פלסמיד.
- הוסף 450 μL של מים או TE לצינור המכיל את תקן DNA פלסמיד מעוכל ומערבבים היטב. העבר 70 μL של תערובת זו לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל עם 1,330 μL מים או TE כדי ליצור תקן פלסמיד מדולל (25 pg/μL).
- עקוב אחר טבלה 1 כדי ליצור קבוצה של דילולים טוריים כפולים (600 μL / צינור). מערבבים היטב את הדילולים על ידי ערבול במשך 5 שניות.
- דנטורציה של תקנים ודגימות DNA ויראלי
- הוסף 600 μL של 2x פתרון אלקליין לכל דילול סטנדרטי. מערבבים היטב על ידי מערבולות במשך 5 עד 10 שניות. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- הוסף 120 μL של 2x Alkaline Solution לכל דגימת DNA נגיפי. מערבבים היטב על ידי מערבולות במשך 5 עד 10 שניות. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- הגדרת מנגנון כתם הנקודות
- בעזרת מספריים, חותכים קרום כתם (למשל, זטה-פרוב) לגודל המתאים למספר הדגימות והסטנדרטים. משרים את הממברנה במים למשך 10 דקות לפני שמניחים אותה על מכשיר כתם נקודה. לכסות בארות שאינן בשימוש על מנגנון הממברנה.
הערה: טפלו בממברנה בפינצטה נקייה. כדי לכסות בארות ריקות, ניתן להשתמש ביריעת ההגנה בצבע תכלת שמגיעה עם הממברנה. אין לאפשר לממברנה להתייבש לפני קשירת דגימות ותקנים. לפרטים נוספים על הרכבת המכשיר והשימוש בו, עיין במדריך למשתמש.
- להוסיף מים לבארות שאליהן יועמסו דגימות. יש למרוח ואקום ולמשוך מים דרך הבארות כדי לבדוק אם יש שגיאות ולבדוק שוב כאשר הם מתוקנים. הדקו מחדש את הברגים תוך כדי מריחת ואקום כדי להבטיח איטום הדוק.
הערה: איטום לא שלם עלול לגרום לדליפת דגימה בין הבארות.
- ברגע שהמים נמשכים לחלוטין, שחררו את הוואקום לחלוטין (כלומר, סעפת הוואקום צריכה להיות פתוחה ללחץ אוויר).
- טעינת תקנים ודוגמאות למנגנון כתם הנקודה
- יש למרוח 400 μL מכל תקן DNA פלסמיד מדולל על כל באר, ולהפעיל ארבעה נתיבים של דילולים סטנדרטיים. השתמש בשני aliquots נפרדים של תקציר סטנדרטי לטעון כל אחד כפול. יש למרוח 200 μL/well מכל דגימת DNA נגיפית.
הערה: באמצעות ~40 μL הנותרים של דגימות דנטורציה, ניתן להכין דגימות מדוללות (למשל, דגימות מדוללות פי 10 באמצעות 20 μL של הדגימה בתוספת 180 μL של 1x תמיסת אלקליין) ולמחוק במידת הצורך.
- מרחו ואקום עדין כדי למשוך את תמיסות הדנ"א דרך הבאר.
הערה: יש לכוונן את לחץ הוואקום על ידי פתיחה חלקית של שסתום תלת-כיווני, כך שלחץ הוואקום יופעל על מנגנון כתם הנקודה וכן על האטמוספירה (כלומר, כאשר זרועות הסטופרקוק ממוקמות בזווית של כ-45 מעלות שם הוא משמיע רעש יניקה חזק יותר).
- לאחר שכל הבארות התרוקנו, שחררו את הוואקום על ידי התאמת השסתום התלת-כיווני. הוסף 400 μL של 1x Alkaline Solution לכל באר שהכילה תקנים ודגימות. המתן 5 דקות לפני שתפעיל מחדש את הוואקום כדי לרוקן את הבארות.
- יש למרוח מחדש את הוואקום באותו אופן.
- לפרק את מנגנון כתם הנקודה מתחת לוואקום, להסיר את הממברנה, ולשטוף אותו עם 2x SSC. הניחו את הממברנה על מגבת נייר נקייה כאשר הצד הקשור לדנ"א פונה כלפי מעלה כדי להסיר עודפי SSC 2x.
- UV-crosslink את ה- DNA המלוטש לממברנה עם crosslinker UV מתאים; הממברנה מוכנה כעת להכלאה.
הערה: ניתן להשתמש בקרומים רטובים עבור crosslinking UV. ניתן לאחסן את הממברנות המיובשות והמוצלבות UV בטמפרטורת החדר. מידע נוסף ניתן למצוא בטבלת החומרים.
2. הכלאה ושטיפה
- חממו את מאגר ההכלאה באמבט מים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
- תייגו באופן אנזימטי בדיקת DNA עם α-32P dCTP רדיואקטיבי וטיהרו אותה באמצעות ערכות זמינות מסחריות בהתאם להמלצת היצרן.
הערה: אנו משתמשים בגשושית באורך 0.5-2.0 קילובייט מאזור מקדם-משפר או ברצף קידוד חלבונים בגנום הנגיפי. למרות שפרוטוקול זה משתמש ב-32גשושיות רדיואקטיביות המסומנות בתווית P לזיהוי אותות, ניתן להשתמש גם בגשושיות כימילומינסנטיות או פלואורסצנטיות שאינן רדיואקטיביות (עיין בסעיף הדיון).
- מניחים את הממברנה בבקבוק הכלאה עם הצד הקשור לדנ"א כלפי מעלה, שוטפים את הממברנה עם 5 מ"ל חיץ היברידיזציה שחומם מראש, ומשליכים את החיץ. לאחר מכן מוסיפים 10 מ"ל של חיץ היברידיזציה שחומם מראש ומניחים את הבקבוק בתנור הכלאה מסתובב המוגדר על 65°C. סובבו במשך ≥5 דקות.
- חום denature 20 μL של 10 מ"ג / מ"ל גזוז הרינג או סלמון זרע DNA פתרון ואת הבדיקה 32P-labeled (≥107 cpm) במשך 5 דקות על ידי הנחת הצינורות על בלוק חום להגדיר על 100 ° C. לאחר מכן מצננים אותם על קרח למשך ≥2 דקות, מסתובבים לזמן קצר ושומרים אותם על קרח עד לשימוש.
זהירות: עבור בדיקות DNA רדיואקטיביות, יש להשתמש בצינורות 1.5 מ"ל עם מכסי בורג ואורינגים.
- הוסיפו במהירות את הדנ"א של הזרע המפורקן ואת הבדיקה הרדיואקטיבית למאגר ההכלאה שבבקבוק ההכלאה ונערו את הבקבוק במשך 10 שניות כדי לערבב. מחזירים את הבקבוק לתנור 65°C ודגרים על הבקבוק בסיבוב ב-65°C למשך ≥4 שעות.
- לאחר השלמת ההכלאה, עצור את הסיבוב, הסר את בקבוק ההכלאה ולאחר מכן שפך את תמיסת הבדיקה הרדיואקטיבית לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם מכסה אטם תקע חסין דליפות. אחסנו את הגשושית במיכל מתאים המונחת במקרר המיועד לחומרים רדיואקטיביים.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר היברידיזציה משומש עם בדיקה המאוחסנת ב -4 מעלות צלזיוס לפחות 5 פעמים על ידי הצבת הצינור החרוטי 50 מ"ל עם מכסה אטם תקע חסין דליפה המכיל חיץ היברידי באמבט מים של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- יש לשטוף את הממברנה עם Wash Buffer שחומם ל-65°C. להוסיף 20 עד 30 מ"ל של Wash Buffer לבקבוק ההכלאה ולסובב במשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו 2 פעמים נוספות.
הערה: למדוד את הרדיואקטיביות של תמיסות שטיפה ולתעד אותה במידת הצורך על ידי המכון המקומי.
- בעת שטיפת הממברנה, הניחו מסך הדמיית זרחן על מחק תמונה למשך 5 דקות.
- לאחר השטיפה השלישית מוציאים את הממברנה מבקבוק ההכלאה, מסירים את החיץ העודף על הממברנה בעזרת מגבות נייר ומניחים את הממברנה במחזיק נייר פלסטיק שקוף. בדוק אותות רדיואקטיביים על הממברנה באמצעות מונה גייגר. חשוף את מסך דימות הזרחן המחוק לממברנה למשך 10 דקות עד לילה, בהתאם לעוצמת האות.
- סרוק את המסך באמצעות מערכת סריקת תמונות זרחן וקבל את הנתונים על עוצמת האות של כל נקודה.
טבלה 1: תקני DNA כמותיים של פלסמיד נקודה כתם. מוצגים נפחים נחוצים של 25 pg/μL תמיסת DNA סטנדרטית של פלסמיד ומים או TE להכנת תקני DNA פלסמיד על ידי דילול טורי כפול (600 μL / צינור). המספרים בעמודת תקן הדנ"א של פלסמיד (0.039 עד 5 ננוגרם) הם כמות הדנ"א ב-200 מיקרוליטר של כל תמיסת דנ"א סטנדרטית של פלסמיד.
| תקן DNA פלסמיד (ng) | נפחים (μL) של 25 pg/μL פלסמיד DNA סטנדרטי פתרון | נפחים (μL) של מים | נפח כולל (μL) |
| 5 | 600 | 0 | 600 |
| 2.5 | 300 | 300 | 600 |
| 1.25 | 150 | 450 | 600 |
| 0.625 | 75 | 525 | 600 |
| 0.313 | 37.5 | 562.5 | 600 |
| 0.156 | 18.8 | 581.2 | 600 |
| 0.078 | 9.4 | 590.6 | 600 |
| 0.039 | 4.7 | 595.3 | 600 |