1. הכנת דוגמאות
- קח 50 מ"ג רקמת עכבר לתוך צינור 1.5 מ"ל. הוסף 200 μL חיץ ליזיס (50 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glycerol), בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז (100 mM NaF, 0.1 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד, 5 מיקרוגרם / מ"ל pepstatin, 10 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, 5 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין).
- הומוגניזציה של הרקמה עם הומוגנייזר במשך דקה אחת על קרח.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-8,000 x גרם ב-4°C.
- אספו את הסופרנאטנט לתוך צינורות חדשים (1.5 מ"ל) והוציאו 1 μL לבדיקת ריכוז חלבון עם ערכת BCA.
הערה: ניתן להשתמש בכל מאגרי הליזיס הנפוצים לניתוח כתמים מערביים ולניתוח כתם נקודה לניתוח QDB.
2. קביעת הספציפיות של נוגדנים
- הכינו ליזטים לדוגמה (20 מיקרוגרם) בסעיף 1.4, BSA ללא IgG (20 מיקרוגרם), וחלבון סטנדרטי (600 pg), לניתוח כתמים מערביים.
הערה: BSA ללא IgG משמש כבקרה שלילית והחלבון הסטנדרטי משמש כבקרה חיובית. הספציפיות של הנוגדן מודגמת על ידי הצגת רצועה אחת בגודל הנכון באמצעות ניתוח הכתם המערבי.
3. הגדרת הטווח הליניארי של ניתוח QDB
- ממיסים את החלבון הסטנדרטי עם ddH2O. מדללים את החלבון לריכוז של 1,200 pg/μL.
- לדלל את החלבון המרוכז מהדגימות המוכנות בסעיף 1.4 עד 4 מיקרוגרם/μL.
- ממיסים את ה-BSA עם ddH2O. מדללים את החלבון לריכוז של 1,200 pg/μL ו-4 μg/μL.
- סדרה של דילולים של חלבון סטנדרטי ודגימות מוכנות הוכנו בהנחיית טבלה 1 וטבלה 2.
- יש לערבב יחד 10 μL דילול סטנדרטי של חלבון או דילול ו-10 μL 2x מאגר העמסה (120mM Tris-HCl pH 6.8, 20% גליצרול, 4% SDS, 0.2% ברומפנול כחול, 200 mM DTT).
- מחממים את התערובות ב-85°C למשך 5 דקות.
4. תהליך ניתוח QDB
- יישום לדוגמה
- תמכו בלוח QDB כדי למנוע מתחתית הצלחת לגעת בפני השטח של השולחן. לדוגמה, השתמש בתיבת קצה פיפטה ריקה כתמיכה.
- טען עד 2 μL של הדגימה למרכז הממברנה בתחתית היחידה הבודדת של צלחת QDB.
- ייבוש הצלחת
- השאירו את צלחת ה-QDB הטעונה למשך שעה אחת בחדר ממוזג (RT) או לחלופין, השאירו את הצלחת הטעונה בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות בחלל מאוורר היטב.
- חסימת הצלחת
- טבלו את צלחת ה-QDB במאגר ההעברה (0.039 M גליצין, 0.048 M Tris, 0.37% SDS, 20% אלכוהול מתיל) ונערו בעדינות את הצלחת במשך 10 שניות.
- שטפו את צלחת QDB בעדינות עם TBST (מי מלח חוצצים טריס, 0.1% Tween 20) שלוש פעמים, ולאחר מכן שטפו את הצלחת במשך 5 דקות ב-TBST תחת ניעור מתמיד.
- חסום את צלחת QDB עם חיץ חוסם (חלב 5% ללא שומן ב- TBST (100 מיקרוליטר / באר) למשך שעה אחת תחת ניעור מתמיד.
- דגירה ראשונית של נוגדנים
- לדלל את הנוגדן הראשוני במאגר החוסם בריכוז שנבחר (מ 1: 500 ל 1: 5,000), ולהוסיף 100 μL לכל באר בודדת של צלחת רגילה 96 באר. הכניסו את צלחת ה-QDB לצלחת בעלת 96 הקידוחים, ודגרו על הלוחות המשולבים במשך שעתיים ב-RT או למשך הלילה ב-4°C תחת טלטול מתמיד.
- לחלופין, הניחו את צלחת QDB בתוך קופסה, ומלאו את הקופסה בחיץ חוסם 2 עד 3 מ"מ מעל חלק הממברנה של הצלחת אם אותו נוגדן משמש לכל הצלחת. מוסיפים את הנוגדן הראשוני בריכוז שנבחר, ודגרים על הצלחת במשך שעתיים ב- RT או לילה ב- 4 מעלות צלזיוס תחת רעד מתמיד.
- שטפו את הצלחת בעדינות עם TBST שלוש פעמים לפני שהיא נשטפת עם TBST שלוש פעמים, בכל פעם במשך 5 דקות תחת ניעור מתמיד.
- דגירה משנית של נוגדנים
- לדלל את הנוגדן המשני במאגר החוסם בריכוז שנבחר (מ 1:1,000 עד 1:50,000), או aliquot 100 μL / well לתוך צלחת 96 באר או בקופסה כמתואר בסעיף 4.4.2 ולאחר מכן לדגור את צלחת QDB בתוך צלחת 96 באר טעונה או את התיבה במשך 1 שעה ב RT תחת טלטול מתמיד.
- שטפו את צלחת ה-QDB בעדינות 3 פעמים עם TBST, ולאחר מכן שטפו את הצלחת 3 פעמים, 5 דקות כל אחת עם TBST תחת ניעור מתמיד.
- כימות
- הכן מצע כימילומינסנציה משופר (ECL) על-ידי ביצוע הוראות היצרן.
- מצע ECL Aliquot לתוך צלחת 96 בארות (100 μL / באר) ולהכניס את צלחת QDB בתוך צלחת 96 באר במשך 2 דקות תחת ניעור מתמיד.
- מוציאים את צלחת ה-QDB מהצלחת בעלת 96 הבארות ומנערים לזמן קצר כדי להסיר את עודפי הנוזלים. מניחים את הצלחת על צלחת מיקרוטיטר לבנה.
- הפעל את קורא המיקרו-צלחות ובחר "צלחת עם כיסוי" בממשק המשתמש לפני הצבת הלוחות המשולבים (צלחת QDB + מתאם לוח לבן) בתוך קורא המיקרו-צלחות לצורך כימות.
הערה: הקפד להשתמש בלוח המיקרוטיטר הלבן והלא שקוף כמתאם כדי למנוע הפרעות מהצלחת. הקפד לבחור "צלחת עם כיסוי" כדי למנוע חסימה של המכונה כאשר לוחות משולבים (צלחת QDB + מתאם צלחת 96 באר) ממוקמים בתוך קורא microplate.
טבלה 1. ערכת דילול לעקומת חלבון סטנדרטית.
| S1
(0pg/μl) | S2 (33.3pg/μl) | S3
(100pg/μl) | S3
(300pg/μl) | S5
(600pg/μl) | S6
(1200pg/μl) |
| חלבון סטנדרטי (1200pg/μl) | 0 | 1.39 | 4.17 | 12.5 | 25 | 50 |
BSA
(4pg/μl) | 50 | 48.61 | 45.83 | 37.5 | 25 | 0 |
| סך | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
טבלה 2. ערכת דילול לדגימות מוכנות
| X1< בר/>
(0μg/μl) | X2< בר/>
(0.25 מיקרוגרם/מיקרוליטר) | X3
(0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר) | X4
(1 מיקרוגרם/מיקרוליטר) | X5
(2 מיקרוגרם/מיקרוליטר) | X6
(4 מיקרוגרם/מיקרוליטר) |
| מדגם (4 מיקרוגרם/מיקרוליטר) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| BSA נטול IgG (4μg/μl) | 50 | 46.875 | 43.75 | 37.5 | 25 | 0 |
| סך | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
