הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה באמצעות ערכות וריאגנטים סטנדרטיים הזמינים מסחרית על מנת להגביר את יכולת השחזור (ראה טבלת חומרים).
1. הכנת דגימות
- מיצוי חלבונים
- העבירו דגימות תאים או רקמות קפואים מ-80°C על קרח יבש, הפשירו על קרח ושטפו לפי הצורך במי מלח חוצצים 1x פוספט קר כקרח (PBS). הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה מיותרים מכיוון שזה ישפיע על איכות החלבון.
- הוסף מאגר בדיקות משקעים רדיואימוניות (RIPA) (25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS) המכיל מעכב פרוטאז 1x לכל דגימה, תוך שימוש בכמות האופטימלית למשקל רקמה.
הערה: בהתאם ליישום, סוג וכמות מאגר ההומוגניזציה עשויים להזדקק לאופטימיזציה נוספת.
- השתמש הומוגנייזר חשמלי כף יד עם מזיק פוליפרופילן כדי הומוגניזציה דגימות רקמות. בין כל דגימה, לשטוף את pestle במים מזוקקים כפול ולייבש אותו עם רקמה נקייה. שנה את המזיק בין תנאי ניסוי שונים ורקמות.
- השאירו את הדגימות על קרח למשך 10 דקות לאחר הומוגניזציה. צנטריפוגה את הדגימות ב >10,000 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש על קרח מבלי להפריע לכדורית. הסופרנאטנט הוא דגימת החלבון. אחסנו את החלבון המופק בטמפרטורה של -80°C או המשיכו ישירות למדוד את ריכוז החלבון.
- כימות ונורמליזציה של ריכוז החלבונים
- מדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביכומונית (BCA). הכן תערובת בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן בלוח אופטי של 96 בארות באמצעות 200 μL של תערובת BCA לכל באר.
הערה: שיטות כימות אחרות כגון מבחני לורי ובראדפורד יכולות לשמש גם לקביעת ריכוז החלבון, כל עוד ריכוז החלבון מכומת באופן עקבי על פני ניסויים.
- הכינו תקני אלבומין בסרום בקר (BSA) בריכוזים הולכים וגדלים בטריפליקט והוסיפו 1 מיקרוליטר מכל דגימת חלבון כפולה. יש לדגור על הצלחת בעלת 96 הבארות בבלוק חום שחומם מראש בטמפרטורה של 60°C למשך 10 דקות או יותר אם ריכוז החלבון צפוי להיות נמוך.
- לאחר הדגירה, מדדו את הספיגה ב-560 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
- יצא את מדידות קורא הלוחות וחשב את ריכוז החלבון על ידי השוואת ערכי הספיגה הממוצעים של כל דגימה לעקומה סטנדרטית המתקבלת באמצעות תקן החלבון. ערך R בריבוע עבור העקומה הסטנדרטית צריך להיות גדול או שווה ל- 0.98 כדי להעריך במדויק את ריכוז חלבון הדגימה.
- לנרמל את כמות החלבון על ידי הכנת דילולים של דגימות חלבון במאגר הדגימה ומים טהורים במיוחד. ניתן להתאים את הנפח הכולל בהתאם לסוג הג'ל המשמש. מומלץ לטעון 30 מיקרוגרם חלבון לכל נתיב ככמות התחלתית. הוסף חומר מחזר כגון dithiothreitol (DTT; ריכוז סופי 5 mM) או בטא-mercaptoethanol (ריכוז סופי 200 mM) לכל דגימה לפי הצורך. פיפטה בטא-מרקפטואתנול לא מדולל במכסה אדים.
- דגרו על הדגימות בגוש חום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הניחו את הדגימות על קרח, מערבולות וסובבו מטה לזמן קצר כדי לאסוף. יש לשמור על קרח עד להעמסת הג'ל.
2. אלקטרופורזה בג'ל של דגימות חלבון
- הגדרת מכשיר וג'ל
- הגדירו ג'ל שיפוע Bis-Tris 4-12% פריקאסט (ראו טבלת חומרים) במערכת תא האלקטרופורזה בג'ל. יש לשטוף את הג'לים במים מזוקקים פעמיים לפני השימוש.
הערה: בהתאם לגודל, לאינטראקציות ולשפע של החלבון המעניין, ניתן להשתמש בג'לים עם שיפוע שונה, חומר חציצה או גודל ומספר באר.
- הוסף 500 מ"ל של חיץ הפעלה אחד מסוג MES SDS המדולל במים מזוקקים פעמיים לכל מיכל. הסר בזהירות את המסרק מהג'לים לאחר הוספת חיץ הריצה מבלי להפריע לבארות בג'ל הערימה.
- העמסת חלבונים
- יש להעמיס 3.5 μL של תקן חלבון לתוך הבאר. בהתאם לפריסת הדגימה, העמסת סולם חלבונים משני צידי הג'ל יכולה לסייע בהערכה מדויקת יותר של גודל החלבון. השתמשו בטיפים עדינים להעמסת ג'ל להעמסת דגימה מדויקת יותר.
- בעת שימוש בתקן פנימי לנורמליזציה בין הממברנות (ראה שלב 5 להלן ודיון), טען כמות השווה לדגימות האחרות לתוך 3 הבארות הראשונות ליד סולם החלבונים.
- עומס 30 מיקרוגרם מכל דגימה בבארות הנותרות. הוסף חיץ מדגם 1x לכל הבארות הריקות.
- אלקטרופורזה
- להרכיב את מיכל הג'ל לאחר טעינת הדגימות. העבירו את הדגימות דרך ג'ל הערימה במתח של 80 וולט למשך 10 דקות ולאחר מכן 150 וולט למשך 45-60 דקות נוספות.
3. העברת חלבונים
הערה: העברת חלבונים בפרוטוקול זה מתבצעת באמצעות מערכת ניקוי חצי יבשה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) לקבלת תוצאות מהירות ועקביות.
- הכינו את העברת החלבון על ידי השריה מראש של נייר הסינון במים מזוקקים פעמיים וודאו שסכין הג'ל, פיפטת פסטר מפלסטיק, רולר הכתמים והמלקחיים מוכנים לשימוש.
- פתח את ערימת ההעברה על-ידי הסרה זהירה של כל נייר הכסף. הסר את החלק העליון מהערימה התחתונה והנח אותו בצד. להרטיב במהירות את הממברנה על הערימה התחתונה עם כמה טיפות של אלקטרופורזה פועל חיץ (2-3 מ"ל). ברגע שערימת ההעברה פתוחה, חשוב למנוע התייבשות של קרום PVDF.
- לאחר הפסקת האלקטרופורזה, פתחו את הג'ל הגבס מראש באמצעות סכין הג'ל וחתכו את ג'ל הערימה. חותכים את הג'ל סביב הקצוות שלו כדי לשחרר אותו מגבס הפלסטיק. יש לשמור על סכין הג'ל רטובה כדי למנוע נזק לג'ל.
- הרכיבו את ערימת ההעברה מלמטה למעלה: ערימה תחתונה (המכילה את קרום PVDF), ג'ל חלבון ונייר סינון. השתמש בגלגלת הכתמים כדי להסיר את כל בועות האוויר. הניחו את הערימה העליונה על גבי נייר הסינון וגלגלו את הערימה שוב כדי להסיר בועות אוויר. אין לדחוף חזק מדי מכיוון שזה עלול לגרום לג'ל להתעוות במהלך העברת החלבון.
- העבר את כל הערימה להתקן ההעברה עם האלקטרודה בצד שמאל של המכשיר והנח את ספוג הג'ל על גבי הערימה כך שהוא מיושר עם המגעים החשמליים המתאימים במכשיר. סגור את המכסה, בחר והפעל את התוכנית המתאימה (20 V למשך 7 דקות היא נקודת התחלה מומלצת).
- בסיום, השאירו את המכסה סגור למשך 2 דקות כדי לאפשר לערימה להתקרר ולמנוע מהממברנה להתייבש. הסר את ערימת ההעברה וחתוך את הממברנה לגודל הג'ל. שטפו את הקרום החתוך במהירות במים מזוקקים פעמיים לפני שתמשיכו עם כתם החלבון הכולל.
4. סה"כ צביעת חלבונים
הערה: שימוש בזיהוי פלואורסצנטי מספק יתרון משמעותי על פני גישות מסורתיות יותר (למשל, זיהוי ECL), מכיוון שניתן לשלוט הרבה יותר טוב בטווח הליניארי וברגישות. לכן, בשלבים 4 ו-5 נעשה שימוש ב-TPS פלואורסצנטי ובנוגדנים משניים פלואורסצנטיים (ראו טבלת חומרים).
- גלגלו את הממברנה לתוך צינור של 50 מ"ל כאשר צד החלבון פונה פנימה. בגלל רגישות האור של TPS פלואורסצנטי ונוגדנים משניים, כל השלבים הבאים מתבצעים בחושך.
- מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת כתמי חלבון (ראו טבלת חומרים) ודגרים על רולר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מכיוון שתב"ע וחיץ השטיפה מכילים מתנול, בצעו שלבים אלה במכסה אדים.
- יש להשליך את תמיסת הצביעה ולשטוף פעמיים במהירות עם תמיסת כביסה במינון 5 מ"ל (6.3% חומצה אצטית ב-30% מתנול). הניחו את הצינור לזמן קצר בחזרה על הרולר בין שלבי השטיפה. יש לשטוף את הממברנה לזמן קצר במים טהורים במיוחד לפני שתמשיך.
5. חסימה, דגירה וזיהוי של נוגדנים
- חסימת הממברנה: הוסף 3 מ"ל של חיץ חוסם (ראה טבלת חומרים) לצינור 50 מ"ל המכיל את הממברנה. דוגרים על הממברנה על רולר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בהתאם לבחירת הנוגדן, סוג מאגר החסימה המשמש עשוי לדרוש אופטימיזציה.
- דגירה ראשונית של נוגדנים
- השליכו את המאגר החוסם והחליפו אותו בנוגדן הראשוני בריכוז המתאים והאופטימלי (איור 1 ואיור 2: עכבר-אנטי-SMN, בקנ"מ 1:1,000, מדולל במאגר חוסם).
הערה: אופטימיזציה נאותה של נוגדנים ראשוניים צריכה לכלול אישור שהנוגדן מזהה מוצר חלבון בגודל הנכון תוך שהוא אינו מראה קשר מינימלי או מינימלי למוצרי חלבון אחרים, לא ספציפיים. במידת האפשר, בדקו והשוו נוגדנים מרובים כנגד החלבון המעניין.
- לדגור את הממברנה על רולר לילה ב 4 °C (75 °F). למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף אותה 6 פעמים במשך 5 דקות עם PBS 1x על רולר בטמפרטורת החדר (RT).
- דגירה משנית של נוגדנים
- הכינו את הנוגדן המשני הספציפי בקנ"מ 1:5,000 כנגד המארח של הנוגדן הראשוני במאגר חוסם של 5 מ"ל. נוגדנים משניים אחרים עשויים לדרוש דילולים אחרים או שימוש במאגרי חסימה חלופיים.
- לדגור על הממברנה עם תמיסת נוגדנים משנית על רולר במשך 1 שעה ב RT. לאחר הדגירה, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים 30 דקות עם 1x PBS על רולר.
- יבשו את הממברנה ושמרו על הממברנה מוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום עד לגילוי. ניתן לשמור את הממברנות בטמפרטורה של 4°C לאחסון לטווח ארוך.
- רכישת תמונות
- היכנס למחשב המחובר לסורק. הניחו את הממברנה על הסורק כשצד החלבון פונה כלפי מטה ובחרו את אזור הסריקה בתוכנה.
- מטב את עוצמת הלייזר עבור שני הערוצים (700 ננומטר ו- 800 ננומטר), על ידי אישור שלא מתרחשת רוויה. רכוש את התמונות בשני הערוצים וייצא את התמונות לניתוח נוסף (שלב 6).
6. ניתוח וכימות כתם מערבי
הערה: המלצות אלה מבוססות על תוכנת Image Studio הזמינה בחינם. עם זאת, ניתוחים דומים יכולים להיעשות גם באמצעות חבילות תוכנה אחרות, כגון ImageJ.
- ייבוא הקובץ: צור סביבת עבודה מקומית במחשב המשמש לניתוח. פעולה זו יוצרת מסד נתונים של קובצי תמונה עבור כתמים מערביים שנרכשו. ייבאו קבצים שהושגו בסורק ובחרו את התמונה לניתוח.
- ניתוח TPS
- הצג את ערוץ 700 ננומטר כדי להציג את התוצאה הכוללת של צביעת החלבון. דוגמה לתמונת TPS כלולה באיור 1 שבה משווים ישירות רקמות שונות מיילודים (P5) (איור 1A-B) ומעכברים בני 10 שבועות (איור 1C-D). באופן דומה, איור 2 מראה דוגמה להשוואה ישירה של רקמת מוח מעכברים בגילאים שונים.
- בחר בכרטיסיה ניתוח בפינה השמאלית העליונה ובחר הוסף מלבן כדי להגדיר את אזור העניין לנורמליזציה (איור 1B, D). העתק והדבק את אזור המלבן הראשון בכל דגימה בנפרד כדי להבטיח שהאזור שהוגדר יהיה באותו גודל עבור כל הנתיבים שנותחו.
- העתק את התוצאה מהכרטיסייה צורות בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה.
- כימות
הערה: הגישה האופטימלית לכימות דגימות תלויה בתכנון הניסוי. נביא כאן דוגמה להמחשה של זיהוי חלבון הנוירון המוטורי ההישרדותי (Smn; חלבון מפתח המעורב במחלה העצבית-שרירית ניוון שרירי עמוד השדרה), אשר ידוע כי הוא פוחת עם הזמן, וכיצד הנורמליזציה של עוצמת אות Smn ל- TPS מספקת הערכות אמינות של התפתחות ביטוי חלבונים.
- איור 2 מראה ירידה בביטוי Smn עם העלייה בגיל של בעל החיים עם TPS כבקרת העמסת חלבון. חזור על שלבים 6.2.1-6.2.3 כדי לכמת את העמסת החלבונים (איור 2B). חזרו על שלבים 6.2.1-6.2.3 בערוץ של 800 ננומטר (איור 2A) כדי לנתח את החלבון המעניין.
- העתק את התוצאות הן מתב"ע והן מחלבון מעניין לתוכנית גיליון אלקטרוני. בגיליון האלקטרוני, ראשית, נרמל את טעינת החלבונים על ידי קביעת אות TPS הגבוה ביותר וחלוקת כל ערך אות TPS בערך זה כדי לקבל את ערך טעינת החלבון המנורמל.
- חלק את ערך האות של 800 ננומטר מכל דגימה בודדת בערך החלבון המנורמל המתאים לה כדי לחשב את יחס ביטוי החלבון היחסי בדגימות שונות.
- לאחר הנורמליזציה הראשונה, השווה נקודות זמן או רקמות שונות לערך הממוצע של התקן הפנימי כדי לאפשר השוואה ישירה בין ממברנות וניסויים שונים.
