כתם מערבי חד-תאי לקביעת הטרוגניות התא

תקציר

מקור: Wang, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/59706">כימות הפעילות הכימוטקטית של מונוציטים ב- Vivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים ממונוציטים בדם. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון מתאר טכניקת הכתמה מערבית חד-תאית המזהה את הרכב התאים הבודדים שנלכדו על שבב כתם מערבי חד-תאי בתרחיף הטרוגני. הטכניקה מזהה את עוצמת הפלואורסצנטיות של הפלואורופור המתויג לסמן חלבוני ספציפי לתא היעד.

פרוטוקול

1. קביעת הרכב התא בתרחיף התא באמצעות ניתוח כתם מערבי חד-תאי (scWB)

1. יש לייבש מחדש את שבב ה-scWB לפני השימוש ב-15 מ"ל של חיץ מתלה 1x בצלחת פטרי למשך 10 דקות לפחות ב-RT.
2. הוסף 1 מ"ל של תרחיף חד-תאי מדולל (10,000-100,000 תאים/מ"ל) לשבב המיובש. הניחו את המשטח על תחתית צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ. ודא שהמשטח מוגדר שטוח.
3. מכסים את צלחת הפטרי במכסה כדי למנוע התייבשות ומניחים לתאים להסתפק 5-15 דקות בשיפוע.
4. מניחים את השבב תחת מיקרוסקופ שדה בהיר ובודקים את הבארות בהגדלה של פי 10.
   הערה: כ 15-20% של microwells צריך להיות תפוס על ידי תא אחד, ופחות מ 2% של בארות צריך להכיל 2 תאים או יותר.
5. הטו את צלחת הפטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה את השבב ב-45 מעלות.
6. שטפו את השבב עם חיץ ההשעיה 1x כדי להסיר תאים שלא נתפסו מפני השטח של השבב על ידי פיפטינג עדין מהחלק העליון לתחתון של השבב. חזור על הפעולה 3 פעמים.
7. הכינו את הכלי המערבי החד-תאי.
8. הגדר את זמן הליזיס, זמן האלקטרופורזה וזמן לכידת UV. כדי לנתח מקרופאגים שגויסו שנמצאו מתקע הג'ל שמקורו בקרום המרתף, השתמש בהגדרות הבאות: זמן ליזיס: 0 שניות; זמן אלקטרופורזה: 160 שניות; זמן לכידת UV 240 שניות.
9. טען בזהירות את השבב לתוך תא אלקטרופורזה של תא בודד מכשיר מערבי, בצד ג'ל פונה. היזהר לא לפגוע בצד הג'ל של השבב.
10. יוצקים את חיץ הליזיס/ריצה לתוך התא ומכסים לחלוטין את כל השבב המערבי החד-תאי. התחל את ליזה התא.
11. הפעל את מכשיר scWB באמצעות ההגדרה המפורטת ב- 1.8.
12. לאחר סיום הריצה, העבירו את השבב לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ ושטפו את השבב פעמיים עם חיץ כביסה אחד למשך 10 דקות ב-RT.
13. הכינו דילולים של נוגדן ראשוני (אנטי-וינקולין: 1:10; אנטי-CD45: 1:15, אנטי-CD11b: 1:20, אנטי-F4/80: 1:10) בנפח כולל של 80 מיקרוליטר של דילול נוגדנים (ערבוב 8 מיקרוליטר של נוגדן 1 ועוד 8 מיקרוליטר של נוגדן 2 ועוד 64 מיקרוליטר של דילול).
14. הוסף 80 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית לתא בדיקת הנוגדנים והורד את צד ג'ל השבב כלפי מטה כך שתמיסת הנוגדנים תתפתל על פני השבב.
15. לדגור עם פתרון הנוגדנים העיקרי במשך 2 שעות ב RT.
16. שטפו את השבב שלוש פעמים במשך 10 דקות במאגר כביסה אחד על השייקר.
17. שטפו את השבב פעם אחת במשך 10 דקות במים על השייקר כדי להתפיל את הג'ל.
18. הכינו דילול 1:20 של נוגדן משני בנפח כולל של 80 μL (ערבבו 2 μL של נוגדן משני בתוספת 78 μL של דילול).
19. לדגור על השבב עם נוגדן משני במשך 1 שעה ב RT מוגן מפני אור.
20. שטפו את השבב שלוש פעמים במשך 10 דקות עם חיץ כביסה אחד על השייקר.
21. סובב את השבב באמצעות ספינר שקופיות כדי להסיר את מאגר הכביסה שנותר.
22. סרוק את השבב באמצעות סורק מיקרו-מערך לייזר כפול ברזולוציה של 5 מיקרומטר בתעלה הספקטרלית של הפלואורופור המחובר לנוגדנים המשניים.
23. נתח נתונים באמצעות תוכנה ספציפית ל- scWB.

2. הפשטת שבב scWB

1. אחסנו את השבב הסרוק במאגר כביסה עד שהוא מוכן להפשטה.
2. הניחו את אמבט המים במכסה אדים.
3. הניחו מתלה צינור של 50 מ"ל באמבט המים עם המים רק 1 ס"מ מעל המדף וקבעו את טמפרטורת המים על 60 מעלות צלזיוס.
4. הכינו את מאגר ההפשטה. עבור 1 ליטר של תמיסת חיץ הפשטה, יש להמיס 9.85 גרם של Tris-HCl (pH 6.8) ו-20 גרם SDS ב-900 מ"ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה-pH. לאחר מכן מלאו במים מזוקקים ל-1L. הוסיפו 0.8% (v/v) של β-מרקפטואתנול (β-ME; 14.3 M) מיד לפני כל שימוש.
5. לאחר הסריקה הראשונית, הניחו את השבב בכלי פטרי בקוטר 10 ס"מ לפני ההפשטה.
6. עבור כל שבב, לקחת 40 מ"ל של חיץ הפשטה ולהוסיף 320 μl של β-ME.
   זהירות: β-ME רעיל ומסוכן לבני אדם ולסביבה. ההליך הבא צריך להיעשות במכסה אדים.
7. מניחים את השבב במיכל ואוטמים את המיכל בפרפילם כדי למנוע דליפת מים לתוך המיכל
8. הניחו את המיכל בתוך מתלה הצינור באמבט המים שחומם מראש.
9. דוגרים במשך 90 דקות.
10. מוציאים בזהירות את השבב מהמכל ומניחים אותו בצלחת פטרי טרייה.
11. שטפו בקצרה את השבב פעם אחת עם מאגר כביסה אחד. לאחר מכן הוסיפו 15 מ"ל של חיץ כביסה 1x לצלחת הפטרי.
12. שטפו את השבב במשך 15 דקות על שייקר. חזור על שלב הכביסה ארבע פעמים.
    הערה: השבב מוכן לנוגדן הראשוני הבא (ראה שלבים 1.12 - 1.21)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ	גריינר ביו-וואן	664 160
חיץ מתלה 10x	חלבוןפשוט	₪250
צלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ	בז	353025
2-מרקפטואתנול	MP BIOMEDICALS	2194705
מאגר כביסה 5%	חלבוןפשוט	₪60
דילול נוגדנים	חלבוןפשוט	042-203
צנטריפוגה עליונה לספסל	בקמן קולטר		מיקרופוגה 22R צנטריפוגה
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A7906-100G
Calcein AM	תרמופישר	C3099	1 מ"ל
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) ארנב mAb	טכנולוגיות אותות סלולריים	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
ראיית Cellometer	Nexcelom
דיספסי	ב.ד.	354235	100 מ"ל
ניתוח מספריים
חמור נוגדן משני IgG נגד ארנב [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 מצומד
חמור נגד עכברוש IgG (H+L) נוגדן משני [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	DyLight 650 מצומד
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
בלוק חום	אפנדורף	22331	תרמומיקסר
ליזה/חיץ ריצה	חלבוןפשוט	₪50
מטריג'ל מטריצה (גורם גדילה מופחת)	ב.ד.	354230	10 מ"ל
סורק Microarray	פרקיןאלמר	ScanArray Gx
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-129
מיקרוסקופ	תרמופישר	Evos fl
מילו	חלבוןפשוט		תא בודד מערבי
מחט	ב.ד.	305111	26 גרם
פארפילם
תא בדיקה	חלבוןפשוט	035-020
עכבר רקומביננטי CCL2/JE/ MCP-1 חלבון	מו"פ	479-JE-050
שבב scWEST	חלבוןפשוט	C300
שאכר	ביואקספרס		שייקר אורביטלי של חבר גנטי
מיכל שבב מערבי חד-תאי	חלבוןפשוט	035-118
ספינר שקופיות	לאבנט	C1303-T
סודיום דודציל סולפט (SDS)	פישר סיינטיפיק	BP 166-500
מזרק	ב.ד.	309602	1 מ"ל
טריס-הידרוכלוריד	פישר סיינטיפיק	BP 153-500
פינצטה	חלבוןפשוט	035-020
אמבט מים	תרמופישר