בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

תקציר

מקור: Hillert-Richter, L. K. et al., מדידת הרכב של CD95 Death-Inducing Signaling Complex ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

פרוטוקול

ניסויי תאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.

1. הכנת תאים לניסוי

הערה: מספר התאים הממוצע עבור משקעים חיסוניים אלה הוא 1 × 10⁷. יש לזרוע תאים דבקים יום אחד לפני הניסוי, כך שיהיו 1 × 10⁷ תאים ביום הניסוי.

1. הכנת תאים דבקים לניסוי
   1. זרעים 5-8 × 10⁶ תאים דבקים ב 20 מ"ל של מדיום (ראה טבלת החומרים להרכב) לכל מצב בכלים של 14.5 ס"מ יום לפני תחילת הניסוי.
   2. ביום הניסוי, ודא כי התאים הם 80-90% קולחים ודבקים במנה. השליכו את המדיום והוסיפו מדיום טרי לתאים הדבקים.
2. הכנת תאי השעיה לניסוי
   1. מניחים בזהירות 1 × 10⁷ תאי תרחיף ב 10 מ"ל של מדיום תרבית (ראה טבלת החומרים להרכב) לכל מצב בכלים של 14.5 ס"מ מיד לפני תחילת הניסוי.
   2. אם אתה משתמש בתאים ראשוניים, בודד תאי T ראשוניים בהתאם להליך שתואר לעיל. יש לטפל בתאי T ראשוניים עם פיטוהמגלוטינין של 1 מיקרוגרם/מ"ל למשך 24 שעות, ולאחר מכן טיפול של 25 U/mL IL2 למשך 6 ימים.
   3. הניחו בזהירות 1 × 10⁸ תאי T ראשוניים ב-10 מ"ל של מדיום תרבית (ראו טבלת חומרים להרכב) לכל מצב בצלחות של 14.5 ס"מ מיד לפני תחילת הניסוי.
      הערה: מספר גבוה יותר זה של תאי T ראשוניים מומלץ, מכיוון שתאים אלה קטנים יותר.

2. גירוי CD95L

1. לעורר את התאים עם CD95L (מיוצר כמתואר קודם או זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ריכוז CD95L וזמן הגירוי תלויים בסוג התא. הכינו תנאי גירוי אחד פעמיים כדי ליצור דגימת 'בקרת חרוזים' במקביל.
   1. לעורר תאים דבקים עם הריכוז הנבחר של CD95L. החזיקו את הצלחת בזווית והכניסו את הליגנד לתווך מבלי לגעת בתאים הדבקים.
   2. לעורר תאי השעיה עם CD95L על ידי צנרת תמיסת הליגנד לתוך תרחיף התא.

3. קציר תאים וליזיס

1. מניחים את צלחות התא על קרח.
   הערה: אין להשליך את המדיום. תאים גוססים צפים בתווך וחשובים לניתוח.
2. הוסף 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS) לתרחיף התא וגרדו את התאים המחוברים מהצלחת. לאסוף את השעיית התא בצינור 50 מ"ל.
3. שטפו את צלחת התא עם 10 מ"ל של PBS קר פעמיים והניחו את תמיסת השטיפה באותו צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 ° C.
4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של PBS קר. העבר את תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ"ל.
5. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את כדור התא עם 1 מ"ל של PBS קר.
6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם למשך 5 דקות, 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של חיץ ליזיס (המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 4%). דוגרים עליו במשך 30 דקות על קרח.
7. צנטריפוגה את הליזט במהירות מרבית (~ 17,000 × גרם) למשך 15 דקות, 4 ° C.
8. מעבירים את הסופרנאטנט (ליזט) לצינור נקי. השליכו את הכדור. קח 50 μL של lysate בצינור אחר. לנתח את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד ולקחת את כמות הליזט המתאים ל 25 מיקרוגרם של חלבון בבקבוקון. הוסף מאגר העמסה (ראה טבלת חומרים להרכב) לבקבוקון. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C כבקרת ליזט.

4. משקעים חיסוניים (IP)

1. הוסף 2 μL של נוגדנים anti-APO-1 ו 10 μL של חלבון A חרוזי sepharose (מוכן לפי המלצת היצרן) לליזט. הוסף רק 10 μL של החרוזים לצינור נפרד המכיל ליזט (דגימה מגורה) כדי ליצור 'בקרת חרוזים'
   הערה: השתמש קצוות פיפט עם פתחים רחבים או על ידי חיתוך הקצוות או קניית טיפים מיוחדים עבור IP בעת טיפול חלבון A חרוז חרוז.
2. לדגור על תערובת הליזט עם נוגדנים/חלבון חרוזי ספארוז עם ערבוב עדין למשך הלילה ב-4°C. צנטריפוגו את הליזטים עם נוגדנים/חלבון חרוזי ספרוז ב-500 × גרם למשך 4 דקות, 4°C. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ"ל PBS קר לחרוזים, וחזרו על שלב זה לפחות שלוש פעמים.
3. השליכו את הסופרנטנט. שואפים את החרוזים רצוי עם מזרק המילטון 50 μL.

5. כתם מערבי

1. הוסף 20 μL של חיץ העמסה 4x (ראה טבלת החומרים להרכב) לחרוזים וחמם ב 95 ° C למשך 10 דקות. חממו את פקדי הליזט ב 95 °C למשך 5 דקות.
2. טען את הליזאטים, ה- IPs ותקן חלבון על ג'ל 12.5% נתרן דודציל סולפט (SDS) (ראה טבלת החומרים להכנת הג'ל) והפעל במתח קבוע של 80 V.
3. העבר את החלבונים מג'ל SDS לקרום ניטרוצלולוז.
   הערה: כאן, הטכניקה היבשה למחצה, המותאמת לחלבונים המעניינים, שימשה להעברה במשך 12 דקות (25 V; 2.5 A = קבוע). משרים את קרום הניטרוצלולוז ושתי ערימות העברה בגודל זעיר בחיץ אלקטרופורזה (ראו את טבלת החומרים להרכב, מכינים לפי הוראות היצרן) למשך מספר דקות לפני ההדבקה המערבית.
4. מניחים את הממברנה הכתם בקופסה וחוסמים אותה למשך שעה בתמיסת חסימה (0.1% טווין-20 ב-PBS (PBST) + 5% חלב). לדגור על הממברנה עם הפתרון החוסם תחת תסיסה עדינה.
5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.

6. זיהוי כתמים מערביים

1. הוסף את הנוגדן הראשוני הראשון בדילול המצוין (ראה טבלת חומרים) לממברנה ודגר עליו למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
2. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.
3. לדגור על הממברנה עם 20 מ"ל של נוגדן משני (מדולל 1:10,000 PBST + 5% חלב) עם ניעור עדין במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
4. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.
5. יש להשליך PBST ולהוסיף כ-1 מ"ל של מצע חזרת פרוקסידאז לממברנה.
6. זהה את האות הכימילומינסנטי (ראה טבלת חומרים).
   הערה: זמן החשיפה ומספר התמונות שצולמו תלויים בכמות החלבון בתא ובספציפיות של הנוגדנים המשמשים. זה חייב להיות מוגדר אמפירית עבור כל נוגדן המשמש לאיתור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12.5% ג'ל SDS	תוצרת עצמית		עבור שני ג'לים נפרדים: 3.28 מ"ל מזוקק H2O 2.5 מ"ל טריס; pH 8.8; 1.5 מטר 4.06 מ"ל אקרילאמיד 100 מיקרוליטר 10% SDS 100 מיקרוליטר 10% APS 7.5 מיקרוליטר TEMED לשני ג'לים לאיסוף: 3.1 מ"ל H2O מזוקק 1.25 מ"ל טריס; pH 6.8; 1.5 מטר 0.5 מ"ל אקרילאמיד 50 מיקרוליטר 10% SDS 25 מיקרוליטר 10% APS 7.5 מיקרוליטר TEMED
צלחות תא בקוטר 14.5 ס"מ	גריינר	639160
אקרילאמיד	קרל רות'	A124.1
קצוות פיפט מסנן אירוסול עם מסנן התאוששות גבוהה ופתח רחב	VWR	46620-664 (צפון אמריקה) או 732-0559 (אירופה)	משמש להצמדת חרוזים לליזט
משמש להצמדת חרוזים לליזט	סיגמא אולדריץ'	A2103	דילול: 1:4000 ב-PBST + 1:100 NaN3
אנטי-APO-1 Ab	מסופק בניסויים אלה על ידי פרופ 'פ 'קרמר או ניתן לרכוש על ידי ENZO	ALX-805-038-C100	משמש רק עבור משקעים חיסוניים
אנטי קספאז-10 Ab	ביוזול	MBL-M059-3	דילול: 1:1000 ב- PBST + 1:100 NaN3
אנטי קספאז-3 Ab	איתות סלולרי	9662 שניות	דילול: 1:2000 ב-PBST + 1:100 NaN3
אנטי קספאז-8 Ab C15	מסופק בניסויים אלה על ידי פרופ 'פ 'קרמר או ניתן לרכוש על ידי ENZO	ALX-804-242-C100	דילול: 1:20 PBST + 1:100 NaN3
אנטי CD95 Ab	סנטה קרוז	SC-715	דילול: 1:2000 ב-PBST + 1:100 NaN3
אנטי-c-FLIP NF6 Ab	מסופק בניסויים אלה על ידי פרופ 'פ 'קרמר או ניתן לרכוש על ידי ENZO	ALX-804-961-0100	דילול: 1:10 PBST + 1:100 NaN3
נוגד FADD 1C4 Ab	מסופק בניסויים אלה על ידי פרופ 'פ 'קרמר או ניתן לרכוש על ידי ENZO	ADI-AAM-212-E	דילול: 1:10 PBST + 1:100 NaN3
אנטי-PARP Ab	איתות סלולרי	9542	דילול: 1:1000 ב- PBST + 1:100 NaN3
APS	קרל רות'	9592.3
β-מרקפטואתנול	קרל רות'	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	ביו ראד	500-0006	משמש בהתאם להוראות היצרן
CD95L	מסופק בניסויים אלה על ידי פרופ 'פ 'קרמר או ניתן לרכוש על ידי ENZO	ALX-522-020-C005
גלאי כימילומינסנציה Chem Doc XRS+	ביו ראד
קוקטייל מעכב פרוטאז מלא (PIC)	סיגמא אולדריץ'	ALX-522-020-C005	הוכן בהתאם להוראות היצרן
DPBS (10x) עם Ca, מ"ג	פאן ביוטק	פ04-53500	דילול 1:10 עם H2O, אחסון במקרר
חיץ אלקטרופורזה	תוצרת עצמית		מאגר אלקטרופורזה 10x: 60.6 גרם טריס 288 גרם גליצין 20 גרם SDS AD 2 ליטר H2O דילול 1:10 לפני השימוש
גליצין	קרל רות'	3908.3
HRP מסוג IgG1 נגד עכבר עיזים	סאות'רן ביוטק	1070-05	דילול 1:10.000 בPBST + חלב 5%
עיזים נגד עכבר IgG2b HRP	סאות'רן ביוטק	1090-05	דילול 1:10.000 בPBST + חלב 5%
עז נגד ארנבות IgG-HRP	סאות'רן ביוטק	4030-05	דילול 1:10.000 בPBST + חלב 5%
אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2)	מרקגרופ/ רוש	11011456001	להפעלת תאי T
KCl	קרל רות'	6781.2
KH2PO4	קרל רות'	3904.1
מאגר טעינה 4x מאגר דגימה Laemmli, 10 מ"ל	ביו ראד	161-0747	הוכן בהתאם להוראות היצרן
לומינאטה פורטה מצע HRP מערבי	מיליפור	WBLUFO500
חיץ ליזיס	תוצרת עצמית		13.3 מ"ל Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 מטר 27.5 מ"ל NaCl; 5 מטר 10 מ"ל EDTA; 2 מ"מ 100 מ"ל טריטון X-100 להוסיף 960 מ"ל H2O
בינוני לתאים דבקים DMEM F12 (1:1) עם גלוטמין יציב, 2,438 גרם/ליטר	פאן ביוטק	פ04-41154	הוספת 10% FCS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 0.0001% Puromycin למדיום
בינוני עבור תאי T ראשוניים	gibco מאת Life Technologie	21875034	הוספת 10% FCS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין למדיום
אבקת חלב	קרל רות'	T145.4
Na2HPO4	קרל רות'	P030.3
NaCl	קרל רות'	3957.2
PBST	תוצרת עצמית		20x PBST: 230 גרם NaCl 8 גרם KCl 56.8 גרם Na2HPO4 8 גרם KH2PO4 זכויות יוצרים © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com עמוד 3 מתוך 3 20 מ"ל Tween-20 ad 2 L H2O דילול 1:20 לפני השימוש
PBST + חלב 5%	תוצרת עצמית		50 גר' אבקת חלב + 1 ליטר PBST
PHA	תרמו פישר סיינטיפיק	R30852801	להפעלת תאי T
פאוור פאק HC	ביו ראד
Precision Plus Protein Standard All Blue	ביו ראד	161-0373	יש להשתמש בין 3-5 μL
חלבון A Sepharose CL-4B חרוזים	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	חרוזי שרף זיקה שהוכנו על פי הוראות היצרן
מגרד	VWR	734-2602
SDS	קרל רות'	4360.2
שאכר	היידולף
נתרן אזיד	קרל רות'	K305.1
טמד	קרל רות'	2367.3
Trans Blot Turbo מיני מחסניות העברה בגודל קטן	ביו ראד	170-4270	משמש בהתאם להוראות היצרן
מאגר העברה TransBlot Turbo 5x	ביו ראד	10026938	הוכן בהתאם להוראות היצרן
TransBlot Turbo קרום ניקטרוצלולוז בגודל קטן	ביו ראד	170-4270	משמש בהתאם להוראות היצרן
טראנס-בלוט-טורבו	ביו ראד
טריס	Chem Solute	8,08,51,000
טריטון X-100	קרל רות'	3051.4
טווין-20	פאן ריאק Appli Chem	A4974,1000