כתם צפוני לזיהוי וכימות מיקרו-רנ"א ספציפי בתמצית RNA כוללת של רקמת צמח

תקציר

מקור: Tirumalai, V., et al. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מדגימים את הכתם הצפוני, טכניקת הכלאה לזיהוי וכימות מיקרו-רנ"א (miRNAs) מסך הרנ"א המופק מרקמת הצמח.

פרוטוקול

1. אלקטרופורזה בג'ל

1. עצור את הריצה מראש ושטוף את הבארות לפני העמסת הדגימה.
2. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ומעמיסים את הדגימות חמות לתוך הבאר באמצעות קצוות נימיים. הכניסו את החוד לתחתית הבאר כך שהמדגם יתפוס שכבה דקה אחת בבאר.
3. טעינה מלאה של כל הדגימות. כלול העמסת סמן עשור RNA.
4. הפעל את הג'ל ב 80 V עד צבע כחול ברומופנול פועל כמעט לחלוטין. Bromophenol blue פועל ב 10 bp בג'ל אקרילאמיד 15% דנטורציה.

2. הכנה לאלקטרו-בלוטינג

1. חתכו את קרום N+ניילון לממדים של צלחת זכוכית ותייגו את הממברנה בפינה הימנית העליונה שלה בעיפרון HB.
2. מניחים בעדינות את הממברנה על פני המים הסטריליים, עם הפנים לצד המסומן לכיוון פני המים. משרים מראש את הממברנה למשך 15 דקות.
3. חותכים 4 חתיכות נייר ניקוי I למידות של כרית סיבים.
4. הכינו את כריך הג'ל על ידי הנחת הצד האפור של הקלטת במגש נקי.
5. הרטיבו מראש את כרית הסיבים והניחו אותה מעל הקלטת. הסירו בועות אוויר.
6. הרטיבו מראש פיסת נייר ניקוי אחת ב-1x TBE והניחו אותה על פד הסיבים. הסר בועות אוויר על ידי גלגול פיפטה פלסטיק על הנייר. הניחו פיסת נייר ניקוי רטובה מראש והסירו בועות אוויר.
7. מוציאים בזהירות את הג'ל מקסטת הריצה ומניחים אותו מעל מערך הכריך, כך שדגימת הרנ"א הטעונה הראשונה תהיה לכיוון ימין.
8. טבלו בעדינות את הממברנה שהושרה מראש ב-1x TBE והניחו אותה מעל הג'ל, עם הפנים כלפי מטה לצד המסומן. יש לגלגל החוצה כדי להסיר את בועות האוויר.
9. טובלים פיסת נייר ניקוי, מניחים אותה על הממברנה ומסירים את בועות האוויר. טובלים פיסת נייר ניקוי נוספת, מניחים אותה מעל מערך הסנדוויץ' ומסירים בועות אוויר.
10. השלימו את הכריך על ידי הנחת פד סיבים רטוב מראש מעל ההתקנה וסגירה חזקה של הקלטת.
11. מקם את קלטת הטרנסבלוט במודול ומלא 1x TBE, pH 8.2, עד לסימן הניקוי.
12. העברה ב 10 V, לילה ב 4 °C (75 °F).
13. לאחר ההעברה, הניחו את הממברנה הלחה על דף נייר ומיד הצליבו את הרנ"א לממברנה על ידי הקרנה עם אור UV של 254 ננומטר (120,000 מיקרוג'אול לסמ"ר). ניתן לאחסן את הכתם הצולב בטמפרטורה של 4°C לצורך הכלאה נוספת.

3. הכנת בדיקה עם תווית רדיו

1. תכננו בדיקה משלימה לחלוטין לרנ"א הקטן שאמור להתגלות.
2. סיימו לתייג את הגשושית באמצעות ƳP32ATP (המתקבל מ-BRIT) בקצה ה-5 אינץ' שלה על ידי שילוב הרכיבים בהתאם למתכון המופיע בטבלה 1.
3. יש לדגור על תערובת התגובה הנ"ל בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
4. הפרד את ƳP32ATP ללא תווית מהגשושית באמצעות עמודת Sephadex G-25 בהתאם לפרוטוקול היצרן.

4.הכלאה של הכתם

1. מניחים את הכתם המוצלב, צד הרנ"א הפונה למעלה, בתוך בקבוק הכלאה.
2. ערבבו במרץ את חיץ ההכלאה הרגיש במיוחד, הוסיפו 10 מ"ל ממנו ודגרו על הכתם בתוך תנור הכלאה הנשמר בטמפרטורה של 35°C, עם סיבוב.
3. בצעו טרום הכלאה במשך 20 דקות.
4. מוציאים את הבקבוק מהתנור ומוסיפים בעדינות את הבדיקה המסומנת למאגר ההכלאה.
5. הכלאה של הכתם ב 35 ° C, עם סיבוב במשך 12 שעות.
6. לאחר ההכלאה, העבירו בזהירות את פתרון ההכלאה לצינור 15 מ"ל. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש חוזר.
7. בצע שטיפה מהירה של הכתם במשך 2 דקות כדי להסיר פתרון היברידיזציה עודף על ידי הוספת 2x מאגר SSC בתוספת 0.5% SDS. בטל את הפתרון.
8. דגור על הכתם עם 2x מאגר SSC בתוספת 0.5% SDS עבור 35°C, עם סיבוב במשך 30 דקות.
9. שטפו שוב את הכתם עם מאגר SSC של 0.5x בתוספת 0.5% SDS עבור 35°C, עם סיבוב למשך 30 דקות.
10. הניחו את הכתם בתוך מכסה הכלאה, הסירו את החיץ העודף ואטמו אותו.
11. חשוף אותו למסך הדמיה ללא קרינה של זרחן למשך הלילה בתוך קלטת.
12. זהה את אות ההכלאה באמצעות הדמיה ביומולקולרית ונתח את התוצאות באמצעות תוכנה מתאימה.

טבלה 1: טבלת מתכונים

חיץ ופתרון	מתכון	הערות
10 X TBE	0.89 מ' חיץ טריס	pH צריך להיות מוגדר ל 8.2 באמצעות חומצה אצטית
	0.89 מ' חומצה בורית
	30mM EDTA
ג'ל לערבב	15% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד סול, 19:1	תערובת ג'ל לא צריכה להכיל גבישי אוריאה
	8 מ' אוריאה
	1X TBE
צבע לטעינת ג'ל	0.05% (עם רב) ברומופנול כחול	יש להקפיד בעת הטיפול בפורמיד נטול יונים;
	0.05 %(w/v) קסילן קסיאנול
	100% דה-יוניזציה - פורממיד
תיוג של בדיקה	מאגר PNK (10X, 2 מיקרוליטר)	תערובת זו מכילה מולקולות רדיואקטיביות, שלב זה חייב להתבצע על ידי צוות מיומן בתוך מעבדה רדיואקטיבית
	אנזים PNK (1 מיקרוליטר)
	אוליגו (100 מיקרומטר, 0.1 מיקרוליטר)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Wash Buffer - I	2X SSC
	0.5% (עם v/v) SDS
Wash Buffer - II	0.5X SSC
	0.5% (עם v/v) SDS
Stripping Buffer - I	0.5X SSC
	0.1% (עם v/v) SDS
Stripping Buffer - II	0.1X SSC
	0.1% (עם v/v) SDS

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
40% תמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמיד	סיגמא	A9926	כימי
אמוניום פרסולפט (APS)	BioRad	1610700	כימי
נייר ניקוי	מהמן נייר ניקוי I	1001-125	בדיקת מעבדה
ברומופנול כחול	סיגמא	B5525-5G	כימי
טיפים להעמסה קפילרית	BioRad	2239915	כלי פלסטיק
פורממיד שעבר דה-יוניזציה	אמביון	AM9342	כימי
בלוק חימום	אפנדורף	5350	מכשיר
Hybond N+קרום ניילון	ג'נרל אלקטריק	RPN203B	בדיקת מעבדה
בקבוק הכלאה	סיגמא	Z374792-1EA	כלי פלסטיק
תנור הכלאה	תרמו סיינטיפיק	1211V79	מכשיר
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	סיגמא	T7024-25 מ"ל	כימי
PhosphorImager	GE- סורק טייפון	29187194	מכשיר
מסך וקלטת PhosphorImager	GE שירותי בריאות	GE28-9564-75	מכשיר
פיפטות	גילסון, דגמים: P20 ו-P10	FA10002M, FA10003M	כלי פלסטיק
פיפטה מפלסטיק	בז	357550	כלי פלסטיק
מנגנון ג'ל פוליאקרילאמיד	BioRad	1658003EDU	מכשיר
Sephadex G-25 עמודה	GE שירותי בריאות	27532501	מכשיר
רכז Speed Vac	תרמו סיינטיפיק	20-548-130	מכשיר
ספינווין	טארסונס	1010	מכשיר
T4 פולינוקלאוטיד קינאז (PNK)	נב	M0201S	בדיקת מעבדה
מנגנון Transblot	BioRad	1703946	מכשיר
חיץ הכלאה ULTRAHyb	אמביון	AM8670	בדיקת מעבדה
אוריאה	פישר סיינטיפיק	15985	כימי
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	מכשיר
מערבולת	טארסונס	3020	מכשיר
אמבט מים	נאולב	D-8810	מכשיר
קסילן ציאנול	סיגמא	X4126-10G	בדיקת מעבדה