$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: החלבונים הרקומביננטיים ששימשו במחקר זה, Hsp90 ו-Cdc37, הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. הפעלת שבב
הערה: כל החומרים שישמשו בניסוי מפורטים בטבלת החומרים. סנן את כל התמיסות המוכנות דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר.
- הכן תמיסת 1-אתיל-3-(3-דימתילאמינו פרופיל) קרבודימיד (EDC) על-ידי הוספת 2 מ"ג של EDC ל-2.5 מ"ל של חיץ חומצה אתנית סולפונית (MES) 1-2-(N-morpholino) אתאן (pH=6.0) בצינור של 15 מ"ל. הכן פתרונות N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) על ידי הוספת 6 מ"ג של sulfo-NHS ל 2.5 מ"ל של 1 M MES buffer (pH = 6.0) בצינור נפרד של 15 מ"ל. Aliquot 50 μL של כל פתרון בצינורות עצמאיים ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.
- ערבב נפחים שווים של תמיסת EDC וסולפו-NHS (50 μL של EDC + 50 μL של sulfo-NHS) על ידי צנרת למעלה ולמטה (לא מערבולת).
הערה: יש להשתמש בתמיסה המעורבת של EDC/sulfo-NHS תוך 30 דקות כדי לשמור על קישור צולב יעיל לתפקוד תקין של שבב.
- הניחו את שבב הביוסנסור (5.7 ס"מ x 2.4 ס"מ; ראו טבלת חומרים) שסופק על ידי החברה בכלי פטרי מזכוכית עם מכסה מותאם. כל שלבי הפונקציונליות הכרוכים בהפעלת השבב מוצעים להיעשות בתוך צלחת הפטרי. החל 50 μL של 1 M MES buffer (pH = 6.0) על שבב biosensor, לדגור במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשאוף את החיץ.
- החל 50 μL של תמיסת EDC/sulfo-NHS באופן מיידי על שבב החיישן. מכסים את צלחת הפטרי ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו תמיסת EDC/sulfo-NHS מהשבב.
- שטוף את השבב פעם אחת עם 50 μL של 1 M מאגר MES (pH = 6.0); שאפו את מאגר MES.
2. אימוביליזציה של חלבון מטרה
- שטוף את השבב 2x עם 50 μL של 1x PBS (pH = 7.4). שאפו את PBS מהשבב והוסיפו את מולקולת המטרה, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
הערה: חוסר התאמה במאגר עלול להרוס את הניסוי כולו; לכן, לפני הניסוי, חשוב לוודא שמולקולת המטרה נמצאת באותו חיץ כמו זה המשמש לכיול (למשל, 1x PBS (pH = 7.4)). במידת הצורך, בצע החלפת חיץ על ידי דיאליזה לילה לפני הניסוי. בניסוי זה, דיאליזה לילית בוצעה עבור שני חלבונים רקומביננטיים, Hsp90 ו- Cdc37, כנגד 1x PBS (pH = 7.4; ראה טבלה של חומרים) עם חילופי חיץ תקין ב 4 ° C. ריכוז חומר המטרה (Hsp90 במקרה זה) עשוי להשתנות בהתאם לפרוטוקולי ניסוי שונים ולאופי חומרי המטרה (חלבון/פפטיד/ליגנדים).
- מכסים את צלחת הפטרי מזכוכית ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את התמיסה המכילה את מולקולת המטרה ושטפו 3x עם 50 μL של 1x PBS (pH = 7.4). שאפו את הפתרון 1x PBS (pH = 7.4) מהשבב.
- הוסף 50 μL של קוונץ '1 (3.9 mM אמינו-PEG5-אלכוהול ב 1x PBS (pH = 7.4)) פתרון לשבב. מכסים את צלחת פטרי הזכוכית ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את פתרון Quench 1 מהשבב.
- הוסף 50 μL של פתרון Quench 2 (1 M אתנולמין (pH = 8.5)) לשבב. מכסים את צלחת הפטרי מזכוכית ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו לתמיסת Quench 2 מהשבב ושטפו את השבב 5x באמצעות 50 μL של 1x PBS, תוך השארת טיפת PBS האחרונה על החיישן.
3. הכנת דגימות אנליטיות
- הכנת סדרת דילול אנליטי עבור Cdc37 בטווח הריכוז הרצוי. בניסוי הראשון נעשה שימוש בריכוזים הבאים: 25 ננומטר, 50 ננומטר, 100 ננומטר, 200 ננומטר, 400 ננומטר, 800 ננומטר, 1,000 ננומטר, 2,000 ננומטר, 3,000 ננומטר ו-5,000 ננומטר. עבור הניסוי השני, קבוצה שונה של ריכוזים הנעים בין 0.4 ננומטר ל 200 ננומטר שימש.
- תכנן את הניסוי כך שיכלול לפחות שמונה ריכוזי אנליטים שונים כדי לקבל ערך KD אמין. להכין את הדילולים השונים של חלבון האנליט באותו חיץ כמו זה המשמש לכיול וחלבון המטרה; כאן זה 1x PBS (pH = 7.4).
4. טעינת שבב biosensor מופעל למכשיר FEB
NOTE: התקן FEB מורכב מקורא המוצג עם חיווי תאורת LED ומחסנית להכנסת שבב הביו-סנסור.
- לאחר אימוביליזציה של חלבון המטרה, הכנס את השבב המופעל למחסנית המכשיר, המחוברת באמצעות USB למחשב. לאחר הכנסת השבב, תוצג נורית LED ירוקה על הקורא המציינת שמכשיר ה- FEB מוכן לניסוי. התקן את התוכנה האוטומטית (ראה טבלת חומרים) שסופקה על ידי החברה במחשב, שאליו מחובר התקן ה- FEB, כדי לפקח על הניסוי שלב אחר שלב כמתואר להלן.
5. הפעל את הניסוי
- לחץ על מודול הפעל ניסוי בתוכנה האוטומטית ובחר 10 נקודות עם רגנרציה או כל פרוטוקול רצוי אחר. מלא את הפרטים הבאים: שם המפעיל, שם הניסוי, תאריך (לדוגמה, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); מאגר התחדשות (לדוגמה, מאגר PBS); המטרה המשותקת (למשל, Hsp90); לנתח בתמיסה (למשל, Cdc37).
- לחץ על הלחצן התחל את הניסוי המוצג בתוכנה ופעל בהתאם להוראות המוצגות על-ידי התוכנה האוטומטית כמתואר להלן.
הערה: התוכנה אוטומטית לחלוטין, ידידותית למשתמש, ומנחה את המשתמש לאורך כל הניסוי צעד אחר צעד. חלון קופץ יופיע על המסך עם הוראות להמשיך הלאה בכל שלב של הניסוי. התוכנה תספק הוראות לכל שלב חוזר ברציפות מכיול, אסוציאציה אנליטית, דיסוציאציה, התחדשות ושטיפה (5x) עבור כל ריכוז אנליטי לאורך הניסוי.
- בצע כיול מכשירים. לשם כך, שאפו את פתרון PBS הנותר מהשבב והחילו 50 μL של חיץ כיול (1x PBS; pH = 7.4). לחץ על הלחצן המשך והמתן 5 דקות עד לסיום שלב הכיול. התוכנה מציגה את נקודת הקצה שנקבעה לשלב הכיול (5 דקות) עם אזעקת אזהרה למעקב.
- לאחר מכן, לבצע אסוציאציה אנליטית. לשם כך, שאפו את חיץ הכיול מהשבב והפעילו 50 μL של ריכוז האנליט הנמוך ביותר (25 ננומטר של Cdc37). לחץ על לחצן המשך והמתן 5 דקות עד לסיום שלב השיוך. התוכנה מציגה את נקודת הקצה עבור שלב השיוך (5 דקות) עם אזעקת אזהרה להמשיך.
- בצע דיסוציאציה אנליטית. כדי לעשות זאת, לשאוף את הפתרון אנליטי מן השבב ולהחיל 50 μL של מאגר דיסוציאציה (1x PBS; pH = 7.4). לחץ על לחצן המשך והמתן 5 דקות עד לסיום שלב הדיסוציאציה (5 דקות). התוכנה מציגה את נקודת הקצה לשלב הדיסוציאציה (5 דקות) עם אזעקת אזהרה למעקב.
- לאחר מכן, בצע התחדשות שבב. לשאוף את פתרון הדיסוציאציה מהשבב ולהחיל 50 μL של חיץ התחדשות (1x PBS; pH = 7.4). לחץ על לחצן המשך והמתן 30 שניות עד לסיום שלב ההתחדשות (30 שניות). התוכנה מציגה את נקודת הקצה לשלב ההתחדשות (30 שניות) עם אזעקת אזהרה למעקב.
- לבסוף, לשטוף את השבב. שאפו את פתרון ההתחדשות מהשבב והחילו 50 מיקרוליטר של חיץ שטיפה (1x PBS; pH = 7.4) על השבב. שאפו את הפתרון מהשבב וחזרו על כך פי 5. השאר את הטיפה האחרונה של מאגר הכביסה על השבב ולחץ על כפתור המשך והמתן 30 שניות עד לסיום משך שלב הכביסה בתצוגת התוכנה.
הערה: התוכנה מציגה את נקודת הקצה לשלב השטיפה (30 שניות) עם אזעקת אזהרה כדי להמשיך במחזור הבא של הניסוי.
- חזור על השלבים עבור כל ריכוז אנליטי שנעשה בו שימוש; חמשת השלבים של כיול, שיוך אנליטי, דיסוציאציה, התחדשות ושטיפה (5x) מהווים מחזור אחד. עבור הניסוי המוצג כאן, ביצענו 10 מחזורים עבור 10 ריכוזי אנליטים (הנעים בין 25 ננומטר ל-5,000 ננומטר או 0.4 ננומטר עד 200 ננומטר; איור 1).
