פוטומטריה המונית לחקר אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים ברמת מולקולה אחת

תקציר

מקור: Wu, D. et. al., Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry. J. Vis. Exp.(2021)

בסרטון זה אנו מדגימים את השימוש בפוטומטריית מסה כדי לחקור אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים בתא זרימה. האור הממוקד מתפזר באופן שונה בהתאם למסת המולקולות. גלאי אוסף את האור המפוזר ויוצר את תבנית ההתאבכות ככתמים בעוצמות שונות, המתואמות את המסות המולקולריות.

פרוטוקול

1. מכינים את תאי הזרימה

1. נקו את כיסויי הזכוכית
   1. בעזרת בקבוקי שטיפה עם מים מזוקקים, אתנול ואיזופרופנול, יש לשטוף את הכיסויים בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ בסדר הבא: מים, אתנול, מים, איזופרופנול, מים. יבשו את הכיסויים עם זרם של חנקן נקי. חשוב לשטוף את הכיסויים מלמעלה למטה, להחזיק את הפינה התחתונה עם מלקחיים רכים. יבשו את הכיסוי באותו כיוון כדי למנוע העברת זיהום מהמלקחיים (איור 1A).
   2. באופן דומה, שטפו את הכיסויים בגודל 24 מ"מ על 24 מ"מ במים מזוקקים, אתנול ומים מזוקקים. יבשו את הכיסויים עם זרם של חנקן נקי.
   3. זהה את צד העבודה של הכיסוי, הנח טיפת מים מזוקקים על פני השטח של הכיסוי הנקי, ובצע את שלבים 3.1-3.2 של הפרוטוקול. בדרך כלל, רק צד אחד של הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ הוא בעל האיכות האופטית המתאימה למדידות MP.
      הערה: לאחר המיקוד, לא ניתן יהיה לזהות פגמים משמעותיים בפני השטח, וערך ה"אות" המוצג בתוכנת איסוף הנתונים צריך להיות פחות מ-0.05% (איור 2A-C). הצדדים הפעילים של כל הכיסויים בקופסה מכוונים לאותו כיוון. יש להשתמש באותו הליך כדי לבדוק את יעילות ניקוי הכיסוי.
2. להרכיב את תא הזרימה
   1. מקם את הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 24 מ"מ על חתיכת רדיד אלומיניום. הניחו רצועות של סרט דו-צדדי על גבי הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 24 מ"מ כפי שמוצג באיור 1B וחתכו את הסרט לאורך קצה הזכוכית. הפרד את הכיסוי מרדיד האלומיניום וחבר אותו לצד העבודה של הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ (איור 1C).
      הערה: גודל הערוץ עשוי להשתנות, אך מומלץ רוחב של 3 מ"מ עד 5 מ"מ. ערוצים רחבים יותר דורשים נפחי דגימה גדולים יותר וערוצים צרים מאוד עשויים להיות קשים לטעינה. בדרך כלל, ניתן ליצור בקלות שני ערוצים מקבילים על הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 24 מ"מ. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הכינו את דגימות הנוגדנים-אנטיגן למדידות הזיקה

1. סנן לפחות 2 מ"ל של מאגר PBS באמצעות מסנני מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקי אבק או אגרגטים. צנטריפוגה את מלאי החלבון למשך 10 דקות במהירות המרבית של הצנטריפוגה השולחנית (בערך 16,000 x גרם).
   הערה: PBS הוא המאגר המומלץ עבור פרוטוקול זה, אך ל- MP אין דרישות חיץ ספציפיות, וגם מאגרים ביולוגיים אחרים מקובלים. עם זאת, ריכוזי גליצרול גבוהים (>10%) ועוצמות יוניות נמוכות מאוד (ריכוז מלח <10 מילימול) עשויים להשפיע על איכות התמונה והנתונים ואינם מומלצים.
2. קבע את הריכוזים בפועל של מלאי הנוגדנים והאנטיגן על ידי מדידת ספיגת UV שלהם 280 ננומטר.
3. חישוב הריכוזים הנמדדים של תערובת האנטיגן-נוגדנים. אם הערך המשוער של זיקת קשירת הנוגדנים אינו ידוע, תכננו להכין דגימה עם ריכוז נוגדנים של 30 ננומטר ושל 20 ננומטר. כאשר הזיקה המשוערת ידועה, יש למטב את יחס הנוגדנים לאנטיגן ואת ריכוזיהם בהתאם לערכי K_d הצפויים. השתמש בריכוז האנטיגן הכולל בתערובת השווה לסכום ה- K_d הצפוי ולריכוז הנוגדנים הכולל במשוואה שלהלן. בהנחה ש- K_d1 = K_d2 עבור שני הפרטופים של הנוגדן, התוצאה תהיה ריכוזים דומים של הנוגדן החופשי ומתחמי הנוגדנים-אנטיגן בדגימה.
   
   התאם את ריכוז הנוגדנים כדי לשמור על ריכוז החלבון הכולל בדגימה בטווח של 10 ננומטר ו- 50 ננומטר. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות באמצעות תערובות עם ריכוזי נוגדנים בין 5 ננומטר ל 25 nM.
   הערה: MP מזהה חלבונים בעלי מסה מולקולרית גדולה מ-40 kDa. כתוצאה מכך, ריכוזי דגימה של אנטיגנים בעלי מסה מולקולרית קטנה מ-40 kDa יכולים לחרוג מהגבול הטיפוסי של 50 ננומטר. עם זאת, בריכוזים גבוהים מכ-100 ננומטר, אפילו אנטיגנים בעלי מסה מולקולרית נמוכה עשויים להשפיע על איכות התמונה והדיוק של קביעת K_d.
4. הכינו 50 μL של תערובת נוגדנים-אנטיגן בריכוז המדידה הסופי שלה המחושב בשלב 2.3.
   הערה: רק דגימה אחת של תערובת נוגדנים אנטיגן נדרשת לקביעת K_d. עם זאת, הכנת מספר דגימות עם יחסי אנטיגן לנוגדנים שונים יכולה לסייע במיטוב ריכוז הדגימה. אם נאספים נתונים ממספר דגימות, ניתן לנתח אותם באמצעות התאמה גלובלית.
5. יש לדגור על תערובות האנטיגן-נוגדנים למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתגובת הקישור להגיע לשיווי משקל כימי. הימנע מזמני דגירה ארוכים שלא לצורך.
   הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לקינטיקה המחייבת. כדי לאשר ששיווי המשקל הכימי הושג, ניתן לחזור על מדידות הדגימה בזמני דגירה שונים. ערכי K_d אינווריאנטיים בזמן מצביעים על דגירה ארוכה מספיק. דגירה ממושכת עלולה להוביל לספיחת חלבונים משמעותית לפני השטח של כלי המעבדה הפלסטיים, וכתוצאה מכך לטעויות משמעותיות בקביעת ריכוז החלבון. מסיבה זו, מומלץ מאוד להשתמש בכלי מעבדה בעלי הדבקה נמוכה להכנת דגימת MP.

3. אסוף את נתוני פוטומטריית המסה

1. מרחו טיפת שמן טבילה במיקרוסקופ על מטרת מכשיר MP והניחו את תא הזרימה המורכב על במת המיקרוסקופ. ודאו שהשמן מכסה את המרווח בין הכיסוי לבין המטרה.
2. טען את תא הזרימה ומקד את פוטומטר המסה.
   1. הפקד 10 μL של תמיסת חיץ נקייה ומסוננת בקצה אחד של תעלת תא הזרימה שהוכנה בשלב 1. נוזל ייכנס לתעלה על ידי פעולה נימית.
   2. כוונן את מיקום Z של הבמה כדי למקד את המיקרוסקופ על משטח העבודה של הכיסוי בגודל 24 x 50 מ"מ.
      1. בכרטיסיה בקרת מיקוד של תוכנת איסוף הנתונים, השתמש בלחצני תנועת השלב הגסה למעלה ולמטה כדי לבצע את ההתאמות הראשוניות.
      2. לחצו על הלחצן 'חדות' כדי להציג את קריאת אות החדות והשתמשו בלחצני הכוונון העדינים 'למעלה' ו'למטה' כדי להגדיל את ערך החדות.
      3. לחץ על הלחצנים הגדר מיקוד ונעל מיקוד כדי להפעיל את פונקציית מעקב המיקוד. תמונה ממוקדת כראוי (איור 2A, C) צריכה להיות בעלת ערך "אות" נמוך מ-0.05%.
         הערה: אם ערך ה"אות" במיקום החדות המרבי הוא מעל 0.05%, הדבר עשוי להצביע על זיהומים על משטח הזכוכית או בחיץ.
3. באמצעות אותה ערוץ, טען 20 μL של דגימת נוגדן-אנטיגן על-ידי הפקדתה בצד אחד של התעלה וניקוי הנוזל מהקצה השני עם פיסת נייר ניקוי קטנה (איור 1D).
   הערה: נפחה של תעלה ברוחב 3–5 מ"מ הוא כ-10 מיקרוליטר. נפח הדגימה הנוסף מומלץ להחליף לחלוטין את המאגר הקיים בתעלה ולמנוע דילול דגימה.
4. לאחר טעינת הדגימה, לחץ מיד על לחצן הקלט כדי להתחיל באיסוף נתונים, תוך השגת סרטון של 100 שניות (איור 2D).
5. בסוף איסוף הנתונים, הזן את שם הקובץ ולחץ על אישור כדי לשמור את קובץ הנתונים.
6. יש להשליך את הכיסויים ולנגב את השמן מהעדשה האובייקטיבית בעזרת מקלוני צמר גפן אופטיים רטובים עם איזופרופנול.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. נתח את נתוני MP

1. עבד את קובץ הווידאו שנאסף באמצעות תוכנת עיבוד הנתונים MP כדי לזהות את אירועי הנחיתה.
   1. השתמש באפשרות File/Open menu כדי לטעון את הקובץ לניתוח ולחץ על Analyze.
   2. לחץ על הלחצן טען כדי לטעון את פונקציית הכיול ולשמור את הנתונים שניתחו באמצעות אפשרות התפריט קובץ/שמור תוצאות בשם.
2. התאימו את התפלגות המסה המולקולרית לפונקציות גאוס כדי לקבל ריכוזים יחסיים של כל מין בדגימה. ניתוח זה יכול להתבצע באמצעות תוכנת גרפים מדעית נפוצה (ראה טבלת חומרים).
   1. ייבא את קובץ "eventsFitted.csv" לתוכנה והתווה את התפלגות המסה המולקולרית (עמודה M בקובץ .csv) באמצעות הפונקציה Plot/Statistics/Histogram.
   2. לחץ פעמיים על ההיסטוגרמה כדי לפתוח את החלון מאפייני התווייה. השבת את הקישור האוטומטי ובחר גודל סל של 2.5 kDa. לחץ על הלחצנים החל ועבור כדי ליצור את נתוני מרכזי הסלים והספירות.
   3. בחר בעמודות Bin Centers ו- Counts והשתמש בפונקציית התפריט Analysis/Peaks ו- Baseline/Multiple Peak Fit כדי להתאים את ההיסטוגרמה לפונקציות Gaussian. לחץ פעמיים כדי לציין את מיקומי השיא המשוערים בתרשים ההתפלגות ולאחר מכן לחץ על הלחצן פתח NLFit.
   4. סמן את תיבות הסימון הקבועות עבור מרכזי השיא "xc" והגדר את ערכיהם למסות המולקולריות הצפויות של הנוגדן החופשי ומתחמי האנטיגן היחיד והכפול. בדוק את האפשרות שתף עבור פרמטרי הרוחב. לחץ על הלחצן התאם. ערכי גובה השיא המותאמים של רכיבי גאוס מייצגים את הריכוז היחסי של כל מין בדגימה.
      הערה: ניתן להתאים את גודל הסל כדי לייעל את הרזולוציה של חלקת ההפצה ההמונית. מגבלת הדיוק של MP היא בערך 1 kDa, וגדלי פחים קטנים יותר עשויים להגביר את רעש ההתפלגות, מבלי לחשוף מידע נוסף. פחים גדולים מאוד יטשטשו את הפרטים הקטנים של הפצה המונית.
3. חשב את חלק הריכוז של כל מין באמצעות המשוואה הבאה:
   
   כאשר ערכי H_I ו- F_I מייצגים גבהים ושברי ריכוז של הנוגדן החופשי והנוגדן הבודד והכפול בדגימה, בהתאמה.

תוצאות

איור 1: הכנה וטעינה של תא זרימה MP. (A) עמדת אחיזה בכיסוי לצורך הליך הניקוי. (B) יישור של הכיסוי בגודל 24 x 24 מ"מ (השכבה האמצעית) והסרט הדו-צדדי (השכבה העליונה) על פני רדיד אלומיניום (שכבה תחתונה, לא מוצג). קווים מקווקווים כחולים מציגים את מיקום הקווים החתוכים. (C) מבט מלמעלה ומהצד על תא הזרימה המורכב עם שני ערוצי דגימה, ותמונה של תא הזרימה המורכב. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AcquireMP	אנונימי		תוכנת איסוף נתונים MP
תרומבין אנטי-אנושי	טכנולוגיות המטולוגיות	AHT-5020	RRID: AB_2864302
אפליקטורים עם קצוות כותנה	תורלאבס	CTA10	מקלוני צמר גפן אופטיים לניקוי עדשות
כיסויים 24x24 מ"מ	גלוב סיינטיפיק	1405-10
כיסויים 24x50 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-544-EP
גלה את MP	אנונימי		תוכנת עיבוד נתונים MP
מלקחיים	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	78080-CF	מלקחיים רכים לטיפול בהחלקות כיסוי
α-תרומבין אנושי	טכנולוגיות המטולוגיות	HCT-0020
שמן טבילה	תורלאבס	MOIL-30
איזופרופנול	אלפא עזר	36644
מיקרוסופט אקסל	מיקרוסופט		גיליון אלקטרוני
OneMP	אנונימי		מכשיר פוטומטריה המוני
מקור	OriginLab		תוכנת גרפים מדעית
PBS	קורנינג	46-013-ס"מ	מלאי פי 10
מסנן מזרק	מיליפור	SLGSR33SS	מאגר וסינון דוגמאות