1. הכנת פד אגרוז (איור 1)
- הניחו מגלשת זכוכית במיקרוסקופ על משטח אופקי שטוח. סדרו שתי שקופיות זכוכית ועליהן שתי שכבות של סרט הדבקה בכל צד של השקופית הראשונית.
הערה: שמור על רווח של 1-2 מ"מ בין שלוש השקופיות המיושרות כדי למנוע מהאגרוז המומס להתפשט בסופו של דבר על השקופיות עם סרט הדבקה.
- פיפטה ויוצקים טיפה של 70 μL של 1% אגרוז מומס על מגלשת זכוכית. הוסף שקופית רביעית בחלק העליון כדי לשטח את טיפת האגרוז ולחץ בעדינות כלפי מטה. חכו כדקה.
- מורידים את המגלשה העליונה ומפילים עם פיפטה כ-3 מיקרוליטר חיידקים ל-3 עד 4 נקודות במקומות שונים על כרית האגרוז.
- לכסות עם כיסוי זכוכית מיקרוסקופית (למשל עובי 22x22 מ"מ #1.5).
הערה: השטיחות והעובי של הכיסויים חשובים לעבודה עם עירורים של שני פוטונים. כיסויים מדויקים עם שטוחות אחידה מבוקרת ואוטופלואורסצנטיות נמוכה הם בדרך כלל בחירה טובה.
- תקנו את הכיסוי עם פרפין מומס כדי לאטום את הכיסוי על מגלשת הזכוכית. התחל על ידי תיקון ארבע הפינות של תלוש הכיסוי.
2. הדמיה במערך מיקרוסקופ של שני פוטונים
הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוך ביתי לסריקת עירור שני פוטונים עם יעד טבילה במים 60x 1.2NA הפועל במצב איסוף פלואורסצנטי ללא סריקה. אורך גל עירור של שני פוטונים נקבע על 930 ננומטר. הוא מסופק על ידי לייזר Ti:Sapphire (קצב חזרה של 80 MHz, ≈ 70 fs רוחב פולס) עובד ב 10-20 mW. פוטונים פלואורסצנטיים נאספו באמצעות מסנן מעבר קצר של 680 ננומטר ומסנן פסים של 525/50 ננומטר לפני שהופנו לדיודת פוטו מפולת סיב מצומדת המחוברת למודול ספירת פוטונים בודדים (TCSPC) מתואם זמן. המיקרוסקופ מצויד גם במנורת פלורסצנטיות שידור. מספר מיקרוסקופים מסוג FLIM-FRET זמינים כעת באופן מסחרי ומתקני הדמיה רבים מצוידים במערכים המסוגלים לבצע מדידות FLIM-FRET.
- השתמש במנורת הפלואורסצנטיות כדי למקד את המטרה על monolayer של חיידקים במדגם ובחר אזורים מעניינים.
- בדקו שתריס לייזר העירור סגור ושהאור האינפרא אדום המגיע מהלייזר חסום ואינו נכנס למיקרוסקופ.
זהירות: יש לתת תשומת לב קפדנית וערנות מתמדת בעבודה עם לייזרים בפולסי IR מכיוון שאור הלייזר אינו ניתן לראייה על ידי העיניים אך כל אקספוזיציה ישירה או השתקפות לייזר חולפת יכולה להיות מזיקה ביותר וליצור נזק בלתי הפיך לעיניים. אנא עיין בנוהלי הבטיחות וההדרכה המקומיים בלייזר לפני השימוש בהגדרות מיקרוסקופיה.
- הניחו את שקופית המיקרוסקופ על הבמה כשהכיסויים פונים למטרה.
- בדקו שמנורת הפלואורסצנטיות דולקת.
- סובב את צריח קוביית המסנן כדי לבחור את קוביית eGFP ופתח את תריס מנורת הפלואורסצנטיות.
- שלח את האור הפלואורסצנטי לכיוון עינית המיקרוסקופ.
אזהרה: יש לוודא שהמסננים המתאימים מושלכים בנתיב האור כדי להיפטר מאור עירור ישיר המגיע ממנורת הפלואורסצנטיות ועלול להזיק לעיניים.
- מקדו את המטרה בחיידקים באמצעות ידית המיקרוסקופ.
- בחר אזור עניין במדגם על ידי תרגומו באמצעות הג'ויסטיק השולט על השלב הממונע < br />
הערה: המיקוד קל יותר עם דגימות פלואורסצנטיות מאוד המאפשרות לראות את הפלואורסצנטיות ישירות דרך העיניים.
- החליפו את העירור עבור לייזר 2PE למדידות FLIM-FRET.
- שלח את נתיב הפליטה הפלואורסצנטי חזרה לכיוון הגלאי.
- סובב לאחור את צריח קוביית המסנן כדי לבחור את הקובייה הדיכרואית עבור לייזר 930 ננומטר.
- הגדר את כוח הלייזר ל -20 mW.
- הגדר את גודל האזור המעניין ל- 30 מיקרומטר. פעולה זו מתאימה את המתח המפעיל את מראות הגאלבו ומגדירה את טווח תנועותיהן (איור 2).
- הפעל את הגלאי והתחל לסרוק את הדגימה - כפתורי ההתחלה והעצירה השולטים בסריקה שולטים גם בפתיחה ובסגירה של תריס הלייזר הן מטעמי בטיחות והן כדי להגביל את ההלבנה של הדגימה (איור 2).
- במידת הצורך, כוונן את המיקוד על ידי הזזת ידית המיקוד העדינה של המיקרוסקופ.
- בחר את שדה הראייה להדמיה על ידי הזזת הבמה בעדינות מממשק המחשב. ניתן לעשות זאת על ההתקנה על ידי הזזת הצלב על התמונה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ (איור 2) שתגדיר את המרכז החדש של התמונה ולחיצה על "שלב הזזה". שדה ראייה טוב לרכישה מתאים לתמונה עם 10-30 חיידקים לא ניידים, כולם ממוקדים כראוי (כל החיידקים נמצאים באותו מישור). אם אתם מעוניינים לחלץ נתוני FLIM-FRET של תאים בודדים, ודאו שהחיידקים מותאמים אישית היטב (פילוח התמונה יהיה הרבה יותר קל).
