בדיקת צבירת תאים לזיהוי אינטראקציות טרנס בין מולקולות היצמדות תאים

Abstract

מקור: Restrepo, S., et al., מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מדגימים את הטכניקה למדידת אינטראקציות טרנס-תאיות בין מולקולות היצמדות תאים סינפטיים באמצעות בדיקת צבירת תאי HEK. בבדיקה זו, מספר שווה של תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים קדם-סינפטית רצויה וחלבון פלואורסצנטי מעורבבים עם תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים פוסט-סינפטית וחלבון פלואורסצנטי נוסף. האינטראקציה בין מולקולות ההיצמדות התא מאלצת את התאים להצטבר, דבר שניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protocol

1. תרבית תאים וטרנספקציה

1. הפוך מדיה סלולרית HEK עם DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של Eagle's Medium) בתוספת 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט, ו 10% FBS. מסנן סטרילי.
2. לקבוע מראש ליגנדות וקולטנים מתאימים לבדיקת צבירה.
   הערה: Neurexin3α SS4+/- ואחד הליגנדים הידועים שלו, LRRTM2, שימשו במחקר זה. ליגנדות וקולטנים בעלי עניין בוטאו מ-cDNA ב-pcDNA3.1. מכלול גיבסון שימש להחדרת Neurexin3α לתוך pcDNA3.1. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. הכינו HEK293T תאים.
   1. לגדל HEK293T תאים למפגש בצלוחית T-75 אחת.
   2. לאחר המפגש, להשתמש 2 מ"ל של טריפסין ומניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיה HEK לבקבוק כדי להשעות תאים ולהעביר את כל 8 מ"ל לצינור חרוטי 15 מ"ל.
   3. גלולה ב 500 x גרם במשך 5 דקות והשהיה מחדש במדיה התאית HEK עבור סך של 8 מ"ל.
   4. ספרו תאים והוסיפו 735,000 תאים לכל באר של צלחת בת 6 בארות. התאם את עוצמת הקול הסופית ל -2 מ"ל עבור כל באר באמצעות מדיה סלולרית HEK.
   5. מניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול בן לילה או עד שהם מגיעים למפגש של 50-60%.
4. להדביק תאי HEK293T בשיטת סידן פוספט.
   1. Transfect well-1 עם 3 מיקרוגרם של חלבון עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- ו 1 מיקרוגרם של mCherry).
   2. Transfect well-2 כמו בשלב 1.4.1. אבל עם חלבון מוטציה של עניין (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfect well-3 עם 3 מיקרוגרם של ליגנד עניין ו co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי אחר (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1 LRRTM2 ו 1 מיקרוגרם של GFP).
   4. Transfect well-4 ו well-5 לשמש בקרות שליליות: well-4 עם 1 מיקרוגרם של GFP ובאר-5 עם 1 מיקרוגרם של mCherry.
   5. הכן צלחת נוספת (כמו בשלבים 1.4.1-1.4.4) אם נדרשים תנאים או פקדים נוספים (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      הערה: יעילות הטרנספקציה מנותחת 24 שעות לאחר הטרנספקציה תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי ומכומתת כמספר התאים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי בו נדבקו. גישה יעילה יותר תכלול טרנספקציה של תאי HEK עם קידוד וקטור ביסיסטרוניק עבור חלבון פלואורסצנטי והליגנד המעניין, והיא מומלצת מאוד מעל טרנספקציה משותפת. במקרה של מחקר זה, אלפא נוירוקסינים הם ~ 4.3 kb ועוצמת פלואורסצנטיות נמוכה נצפתה באמצעות מערכת bicistronic הדורשת co-transfection.
5. 48 שעות לאחר ההדבקה, קציר תאים לצבירה.
   1. לשטוף כל באר פעמיים עם PBS.
   2. הוסף 1 מ"ל של 10 mM EDTA ב- PBS לכל באר כדי לנתק בעדינות אינטראקציות בין תאים ולדגור על הצלחת ב- 37 ° C למשך 5 דקות
      הערה: טריפסין אינו מומלץ לשלב 1.5.b בשל הפיצול הפרוטאוליטי הפוטנציאלי של מולקולות הידבקות במחקר. בנוסף, לאחר הוספת EDTA ייתכן שהפרוטוקול לא יופסק עד להשלמתו מכיוון שהתאים יהיו חשופים כעת לתנאי הסביבה.
   3. טפחו בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, וקצרו כל באר לצינורות חרוטיים נפרדים של 15 מ"ל.
   4. צינורות חרוטיים צנטריפוגות ב 500 x גרם ובטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
6. בזמן שהתאים הם כדוריות, הכינו 6 צינורות דגירה על ידי סימון החלק העליון של כל צינור מיקרוצנטריפוגה עם כל מצב.
   הערה: יש להשתמש בכל פרמוטציה של תנאי GFP ו-mCherry כדי להקיף את כל תנאי הניסוי והבקרות המתאימות. לדוגמה: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. צור צינורות נוספים כדי להתאים לתנאים ובקרות נוספים.
7. הסר את תאי הסופרנאטנט וההשהיה מחדש במדיה של 500 μL HEK עם 10 mM CaCl₂ ו- 10 mM MgCl₂ מחוממים ל- 37 ° C.
   הערה: התוספת של CaCl₂ ו-MgCl₂ מאפשרת למולקולות היצמדות ליצור מחדש את הקשירה ונדרשת רק אם השותפים לאינטראקציה הטרנס-תאית המדוברים זקוקים לקטונים דו-ערכיים להידבקות.
8. ספור את התאים בכל צינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות המוציטומטר ואליקוט 200,000 תאים מכל מצב לצינור מתאים משלב 1.6 לקבלת תערובת של 1:1 בנפח כולל של 500 μL.
   הערה: זה אמור לקחת רק 5 דקות לכל תנאי כדי לספור כמויות aliquot.
9. דוגרים על צינורות בטמפרטורת החדר במסובב צינור איטי.

2. רכישת תמונות

1. מטב פרמטרים של רכישת מיקרוסקופ עבור דגימות ספציפיות. בדוגמה זו, התמונות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה. השתמש במטרה אווירית 5x (NA: 0.15; WD: 20000 מיקרומטר) כדי לקבל שדה גדול מספיק לניתוח.
2. הערך צבירה בסיסית מיד לאחר ערבוב שני התנאים של תאי HEK בשלב 1.8. אלה עכשיו תמונות 'זמן אפס'.
   1. פיפטה 40 μL של כל תערובת דגימה על גבי שקופית מיקרוסקופ טעונה ותמונה תחת פלואורסצנטיות בשני ערוצי 488 ו- 561.
   2. קבל שלושה שדות ראייה שונים במישור מיקוד אחד לכל טיפת דגימה.
3. קבל תמונות סופיות ב- 60 דקות כתמונת 'זמן 60'.
   1. כדי לקבל את תמונת 'זמן 60' של התערובת לאחר דגירה של 60 דקות, קח דגימה נוספת של 40 μL מכל מצב מצינוריות מסתובבות ופיפטה כל דגימה לשקופית טעונה. תמונה כמו בשלב 2.2.
      הערה: יש לבדוק את צבירת התאים כל 15 דקות עד להתרחשות רוויה. עיתוי הצבירה יהיה תלוי בחלבונים הנבדקים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 מ"ל מיקרו-צינורות חד פעמיים עם כובעי הצמדה	VWR	89000-028	דגירה של אוכלוסייה מעורבת של תאי HEK
1000 מ"ל מהיר - יחידת מסנן זרימה, קרום 0.2 um aPES	תרמו פישר	567-0020	עיקור מדיה HEK
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות SpectraTube	המדע של וורד	470224-998	קצירת תאי HEK
צלחות תרבית רקמה סטריליות 6 בארות	VWR	100062-892	טיפוח תאי HEK
סידן כלורי	סיגמא	223506-500ז	העברת סידן פוספט, תרחיף תאי HEK
צנטריפוגה - Sorvall Legend RT	מוצרי מעבדה של Kendro	75004377	קצירת תאי HEK
אינקובטור תאי CO2	תרמו סיינטיפיק	HERACELL 150i	דגירה של תאי HEK במהלך הצמיחה
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט	קורנינג	10-013-CV	תחזוקת תאי HEK
PBS מלוחים חוצצי פוספט של Dulbecco (1X)	גיבקו	14190-144	עובר/קציר תא HEK
חומצה Ethylenediaminetetraacetic	סיגמא	ED-500G	קצירת תאי HEK
צלוחיות תרבית מאווררות בז, שטח גידול של 75 סמ"ר	קורנינג	9381M26	טיפוח תאי HEK
סרום בקר עוברי	סיגמא	17L184	תחזוקת תאי HEK
HEK293T תאים	ATCC		מערכת דגמים
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	ניתוח תמונות
מגנזיום כלוריד הקסהידראט	סיגמא	M9272-500G	השעיית תאי HEK
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים	פישר ביוריאגנטים	BP332-500	טרנספקציה של סידן פוספט
טריפסין 0.25% (1X) פתרון	GE Healthcare מדעי החיים	SH30042.01	העברת תאי HEK
מסובב צינור			דגירה של אוכלוסייה מעורבת של תאי HEK
שקופיות מיקרוסקופ UltraClear. לבן קפוא, חיובי טעון	דנוויל סיינטיפיק בע"מ	M1021	רכישת תמונות
מיקרוסקופ שדה רחב	זיס	Axio Vert 200 מטר	רכישת תמונות