בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

תקציר

מקור: Wang, X., et al., In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay.J. Vis. Exp.(2020)

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה משתמש בזני C. elegans שבהם שני השותפים הפוטנציאליים לאינטראקציה מתויגים. מומלץ מאוד להשתמש בזן בקרה שלילי, שבו חלבון מתויג אחד אינו צפוי לקיים אינטראקציה עם שותף אחר לאינטראקציה מועמד מתויג. כאן, GFP לבדו שימש כבקרה שלילית להערכת רקע, שכן DLC-1 אינו צפוי לקיים אינטראקציה עם GFP בתולעת. OMA-1 המתויג GFP שימש כזן הניסוי, שכן נתונים ראשוניים מצביעים על אינטראקציה עם DLC-1. זני נמטודות המבטאים במשותף חלבוני בקרה ובדיקה עם DLC-1 המתויג 3xFLAG מכונים בטקסט זה 3xFLAG::D LC-1; GFP ו- 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (זנים זמינים לפי בקשה; מידע נוסף בטבלת החומרים), בהתאמה. כאן, תגי 3xFLAG ו- GFP משמשים; עם זאת, תגים אחרים עשויים להיות מוחלפים כל עוד הנוגדנים שלהם תואמים ריאגנטים ערכת PLA.

1. טיפול בבעלי חיים

1. יש לשמור את התולעים על לוחות גידול בינוניים של נמטודות (NGM) הנזרעים עם זן OP50 של E. coli ולשמור על טמפרטורה של 24°C לביטוי מיטבי של GFP.
2. מעבר תולעים בוגרות כל 2-3 ימים כדי להפיץ תולעים ולשמור אותם מוזנים היטב.

2. הכנת תרבות סינכרונית

1. סנכרן תולעים על ידי הלבנת צלחת של הרמפרודיטים הניזונים היטב, gravid. פרוטוקול הלבנה מתואר ב- Porta-de-la-Riva et al. תנו לעוברים לבקוע לילה בצינור צנטריפוגה בטמפרטורה של 24°C תוך סיבוב מקצה לקצה ב-10 מ"ל של חיץ מדיה מינימלי M9 (M9). זה ייצור תרבית של זחלי L1 עצורים.
2. יש לדגור על הצינור של זחלי שלב L1 עצורים על קרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן מעל הצינור עם 1x M9 קר כקרח.
3. השתמש בצנטריפוגה כדי לשגר את הזחלים ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף את supernatant כך רק 1-2 מ"ל של supernatant נשאר.
4. השהה מחדש את גלולת הזחלים והשתמש במיקרופיפטה כדי להעביר 2 מיקרוליטר של תרבית זחלים מרחפים למגלשת זכוכית. ספרו כמה זחלים קיימים כדי לקבוע את צפיפות תרבית הזחלים, מה שיעזור להנחות את זריעת התולעים בשלב 2.5.
   הערה: צפיפות של 10-15 זחלי L1/1 μL מתאימה לזריעה.
5. השתמש במיקרופיפטה כדי להעביר את נפח תרבית הזחלים הדרוש כדי לזרוע כ 100-120 זחלי שלב L1 על צלחת OP50 60 מ"מ. לדוגמה, זרע 10 μL של תרבית זחלים שיש לה צפיפות של 10 L1 זחלים / 1 μL של תרבית.
   הערה: אין לחרוג מנפח של 40 μL כדי לזרוע את הזחלים, אחרת עודף נוזלים ישבש את הדשא OP50. אם נפח התרבית עולה על 40 מיקרוליטר, חזור על שלבים 2.3-2.4 כדי להפחית עוד יותר את הנפח ולהגדיל את צפיפות תרבית הזחלים.
6. לגדל תולעים ב 24 ° C. רשום את הזמן שבו L1s נזרעים על הצלחת ולבדוק מעת לעת את שלב הפיתוח כדי לזהות את הזמן האידיאלי לדיסקציה.
   הערה: 52 שעות לאחר הזריעה של L1s, תולעים בתרבית ב 24 ° C הם בדרך כלל בשלב הבוגר הצעיר, שהוא השלב האידיאלי עבור PLA ממוקד גונאד. עם זאת, הזמן בפועל שבו התולעים המסונכרנות מגיעות לשלב הבוגר הצעיר עשוי להשתנות בין הזנים וטמפרטורת הדגירה.

3. דיסקציה/שחול גונאד

הערה: דיסקציה כדי להוציא את הגונד נחוצה כדי ש-PLA ממוקד גונאד יפעל בהצלחה. גישה זו יכולה גם לשחרר עוברים, אשר פועלים גם באמצעות פרוטוקול זה עבור PLA (ראה דיון למידע נוסף). לאחר הדיסקציה, הן דגימות הבקרה השלילית והן דגימות הניסוי קבועות ומטופלות עבור PLA יחד במקביל. כמו כן, מוצע להכין קבוצה נוספת של דגימות לצורך קו-אימונוסטיין פלואורסצנטי כדי להדגים דפוסי ביטוי של שותפי החלבון המעניינים.

1. בחר 30-40 תולעים בוגרות צעירות לתוך צלחת זכוכית שעון המכילה 500 μL של 1x M9 + levamisole (ריכוז סופי 2.5 mM). לאחר איסוף התולעים, בזהירות להסיר ולהשליך את רוב התקשורת כדי להסיר חיידקים המועברים יחד עם התולעים.
2. הוסף 500 μL טרי של 1x M9 + levamisole ולהשתמש פיפטה כדי למשוך בעדינות ולהוציא את המדיה כדי לשטוף את התולעים. בזהירות להסיר ולהשליך את רוב המדיה כדי לנקות חיידקים המועברים יחד עם התולעים.
   1. חזור על שלב זה 2x-3x עד שכל החיידקים יוסרו. לאחר שטיפות הושלמו, להשאיר תולעים על 100 μL של מדיה כדי לשמור על hydrated.
      הערה: אל תתנו לתולעים לשבת בתקשורת יותר מ -7 דקות, מכיוון שזה יפגע בשחול של גונדות במהלך נתיחה. בצע שטיפות בעזרת מיקרוסקופ לנתח כדי לפקח על הסרת התקשורת, כך תולעים לא יאבדו.
3. באמצעות פיפטה מזכוכית או פוליאתילן, מעבירים תולעים לשקופית מיקרוסקופ בגודל 25 מ"מ x 75 מ"מ המצופה בפולי-ליזין 0.001% (לשקופיות המשמשות בהליך זה יש היקף מצופה אפוקסי, המשאיר שלוש סביבות עבודה, 14 מ"מ x 14 מ"מ כל אחת). הסר מדיה עודפת כך כ 10-15 μL של מדיה נשאר.
4. בעזרת מיקרוסקופ מנתח ובאמצעות שתי מחטי מד 26 וחצי, מניחים מחט אחת על פני השנייה כך שהקצוות יוצרים זוג מספריים. באמצעות מחטים בכיוון זה, לחתוך תולעים מאחורי הלוע כדי לשחרר את הנבט. לנתח את כל התולעים בתוך 5 דקות.
   הערה: פרטים נוספים על אופן ביצוע הניתוחים ניתן למצוא בפרסום קודם של Gervaise and Arur.
5. לאחר ניתוח כל התולעים, הניחו בעדינות כיסוי בגודל 22 מ"מ x 40 מ"מ מעל המגלשה כך שהיא תהיה בניצב לשקופית. קצות תלוש הכיסוי צריכים להיתלות מעל המגלשה.
6. הקפיאו את המגלשות על בלוק אלומיניום מצונן מראש שנשמר על קרח יבש למשך 20 דקות לפחות. הניחו בעדינות עיפרון צונן על גבי הכיסוי כדי למנוע מהכיסוי להשתחרר עקב התפשטות קרח.

4. קיבוע/חסימה

1. כאשר אתם מוכנים לקיבוע, החליקו את הכיסויים בעזרת עיפרון או כלי קהה אחר ומיד טבלו את המגלשה בצנצנת המכילה מתנול טרי וקר כקרח (מקורר ל-20°C-) למשך דקה אחת.
2. נגב בעדינות את קצוות השקופית המקיפים את הדגימה, כך שהמגיב הבא יוחזק על ידי מתח פני השטח סביב הדגימה. החל 150 μL של קיבוע (2% פורמלדהיד ב 100 mM KH₂PO_4, pH = 7.2) במשך 5 דקות ב RT.
   הערה: בדקנו גם הליך קיבוע מתנול/אצטון ומצאנו שהוא תואם לתגובת PLA.
3. גע במגבת נייר בזווית ניצבת של 90° כדי לאפשר לקיבוע לברוח מהמגלשה ולהיספג במגבת הנייר. בלוק מחליק פעמיים למשך 15 דקות ב-RT בצנצנת Coplin עם 50 מ"ל של 1x PBS/1% Triton X-100/1% אלבומין בסרום בקר (PBT/BSA).
   הערה: צנצנות קופלין או סוגים אחרים של צנצנות צביעה מומלצות לשלב חסימה זה ולשלבי הכביסה להלן בסעיפים 6-9. אלה מספקים נפחים מספיקים להחלפה יעילה של חסימה או חיץ כביסה עם הדגימה.
4. חסום שקופיות עם תמיסת PBT/BSA המכילה 10% סרום עיזים רגיל. נגב בעדינות את הקצוות המקיפים את השקופית והחל 100 μL של התמיסה על השקופית. דגירה במשך שעה אחת ב- RT בתא לח.
   הערה: שלב זה מומלץ מאוד להכתמה בנוגדן הראשי αFLAG. התא הלח נבנה על ידי אבטחת פיפטות זכוכית עם סרט במגש עבור המגלשות לשכב על בזמן שהם דוגרים. מגבוני משימה רטובים (טבלת חומרים) מונחים במגש כדי להעלות את הלחות הפנימית של המגש כדי למנוע אידוי. המכסה והמגש מכוסים בנייר כסף כדי להגן על הדגימות מפני אור במהלך השלבים הרגישים לאור.
5. הנח את השקופית על מגבת נייר כדי לאפשר לתמיסת PBT/BSA/10% NGS לזרום מהמגלשה ונגב בעדינות את קצוות המגלשה. השתמש במגיב החוסם (רשימת חומרים) כדי לחסום שקופיות. יש למרוח טיפה אחת על שטח של 14 מ"מ x 14 מ"מ. יש לדגור על מגלשות במשך שעה אחת ב-37°C (77°F) בתא לח.

5. דגירה ראשונית של נוגדנים

הערה: כדי להשיג את תוצאות ה- PLA הטובות ביותר ורקע מינימלי, גורם הדילול של הנוגדנים הראשוניים עשוי לדרוש אופטימיזציה (ראה דיון לפרטים נוספים). בנוסף, יש להעלות את הנוגדנים הראשוניים במארחים שונים התואמים את הספציפיות של הנוגדנים המשניים המשמשים ל- PLA.

1. הניחו את ההחלקה על מגבת נייר כדי לאפשר למגיב החוסם לברוח מהמגלשה ונגבו בעדינות את הקצוות. השתמש במדלל הנוגדנים (טבלה של חומרים) כדי לדלל את הנוגדנים הראשוניים. החל 40 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל 14 מ"מ x 14 מ"מ רווח.
2. לדגור על שקופיות בתא לח לילה ב 4 °C (75 °F).

6. דגירה של בדיקת PLA (נוגדנים משניים)

הערה: עבור שלבים 6-9, השתמש במאגרי כביסה A ו- B ב- RT. אם המאגרים מאוחסנים בטמפרטורה של 4°C, יש לתת להם להתחמם ל-RT לפני השימוש.

1. שטפו שקופיות פעמיים במשך 5 דקות עם 50 מ"ל של 1x חיץ כביסה A (טבלת חומרים) ב-RT בצנצנת Coplin. הניחו את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי, המכוון ל-60 סל"ד.
2. הניחו את המגלשה על מגבת נייר כדי לאפשר למאגר הכביסה לברוח מהמגלשה ונגבו בעדינות את הקצוות. הכינו תמיסה של 40 μL המכילה בדיקות PLUS ו-MINUS (מדוללות ביחס 1:5 עם דילול נוגדנים). החל את הפתרון על כל חלל של 14 מ"מ x 14 מ"מ.
3. לדגור שקופיות בתא לח במשך 1 שעה ב 37 °C (77 °F).

7. קשירה

1. שטפו את המגלשות פעמיים למשך 5 דקות עם 50 מ"ל של חיץ כביסה A אחד ב-RT בצנצנת קופלין. הניחו את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי, המכוון ל-60 סל"ד.
2. יש לדלל את חיץ הקשירה (טבלת חומרים) ביחס 1:5 במים טהורים במיוחד. השתמש במאגר זה כדי לדלל את הליגאז (טבלת חומרים) 1:40 כדי להכין מלאי עבודה של תמיסת קשירה.
   1. הניחו את המגלשה על מגבת נייר כדי לאפשר למאגר הכביסה לברוח מהמגלשה ונגבו בעדינות את הקצוות. יש למרוח 40 μL של תמיסת הקשירה על כל חלל בגודל 14 מ"מ x 14 מ"מ.
3. דגרו על מגלשות בתא לח למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

8. הגברה

הערה: שימוש בריאגנטים לזיהוי עם פלואורופורים אדומים (רשימת חומרים) מביא לכמות הקטנה ביותר של רקע ברקמת C. elegans.

1. שטפו את המגלשות פעמיים למשך 5 דקות עם 50 מ"ל של חיץ כביסה A אחד ב-RT בצנצנת קופלין. הניחו את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי, המכוון ל-60 סל"ד.
2. יש לדלל את החיץ האדום של ההגברה (טבלת חומרים) ביחס 1:5 במים טהורים במיוחד. השתמש במאגר זה כדי לדלל את הפולימראז (טבלת חומרים) 1:80 כדי להכין מלאי עבודה של תמיסת הגברה ולהגן מפני אור.
   1. הניחו את המגלשה על מגבת נייר כדי לאפשר למאגר הכביסה לברוח מהמגלשה ונגבו בעדינות את הקצוות. החל 40 μL של תמיסת ההגברה על כל חלל 14 מ"מ x 14 מ"מ.
3. יש לדגור על מגלשות בתא לח למשך שעה ו-40 דקות בטמפרטורה של 37°C. ודאו שהחדר הלח מכוסה בנייר כסף כדי להגן על הדגימות מפני אור.

9. שטיפות סופיות

1. שטפו שקופיות פעמיים למשך 10 דקות עם 50 מ"ל של חיץ כביסה B (טבלת חומרים) אחד ב-RT בצנצנת Coplin. הניחו את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי, המכוון ל-60 סל"ד.
2. שטפו שקופיות פעם אחת למשך דקה אחת עם 50 מ"ל של חיץ כביסה B 0.01x ב-RT בצנצנת Coplin. הניחו את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי, המכוון ל-60 סל"ד. חיץ זה מוכן על ידי דילול חיץ כביסה B עם מים טהורים במיוחד.

10. הרכבה בכיסוי

1. הניחו למאגר השטיפה העודף לזרום מהמגלשה על מגבת נייר ונגבו את שאריות החיץ שנותרו על ההיקף המצופה אפוקסי של המגלשה.
2. הוסף 10 μL של אמצעי הרכבה (טבלה של חומרים) כדי לדגום ולהניח בעדינות כיסוי על גבי, המאפשר את אמצעי ההרכבה להתפשט.
3. צבעו מסביב לקצה הכיסוי בלק כדי לאטום את הכיסוי ולהחליק. היו עדינים עם מריחת לק כדי להימנע מהזזת הכיסוי, מה שיפגע בחיידקים. תנו ללק להתקשות למשך 20 דקות לפחות ב-RT, בזמן שהשקופיות מוגנות מפני אור, לפני שתצפו בו תחת מיקרוסקופ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16% תמיסת פרפורמאלדהיד	שירותי מיקרוסקופיית אלקטרונים	15710	משמש לייצור פתרון עבודה של 4%
1M KH2PO4	סיגמא	P0662	הכנת מלאי עבודה של 1M
M9 אחד	מגוון	מגוון	מוכן כמלאי פי 10 המשמש ב-1x; ראה פרוטוקול wormbook.org
1x PBS	מגוון	מגוון	ראה wormbook.org לפרוטוקול
מחט 26.5 מד	אקסל אינטרנשיונל	26402	מחטים המשמשות לדיסקציה
BSA	למפייר	7500802
צינורות צנטריפוגות	תרמו סיינטיפיק	05-529ג	50 מ"ל צינור צנטריפוגה אוק רידג' המשמש לסנכרון
מיקרוסקופ קונפוקלי	זיס	880
צנצנת קופלין	פולילאב	62101
כיסויים להקפאת דגימה	גלוב סיינטיפיק	1411-10	22x40 מ"מ, מס' 1
מכסה לשקופית אטימה	גלוב סיינטיפיק	1404-15	22x22 מ"מ, מס' 1.5
DAPI אמצעי הרכבה עבור immunofluorescence	וקטור	H-1200
ליגאסה	סיגמא-אולדריץ'	DUO82029	Duolink 1x Ligase, מגיע כחלק מהערכה האדומה Duolink In Situ Detection Reagents DUO92008
חיץ אדום הגברה	סיגמא-אולדריץ'	DUO82011	Duolink 5x Amplification Red buffer, מגיע כחלק מהערכה האדומה Duolink In Situ Detection Reagents DUO92008
חיץ קשירה	סיגמא-אולדריץ'	DUO82009	מאגר קשירה Duolink 5x, מגיע כחלק מהערכה האדומה Duolink In Situ Detection Reagents DUO92008
דילול נוגדנים	סיגמא-אולדריץ'	DUO82008	מדלל נוגדנים Duolink,מגיע עם DUO92004 ו DUO92002, הערה: 1x PBS / 1% BSA פתרון יכול לשמש גם כתחליף לדלל את הנוגדן.
פתרון חסימה	סיגמא-אולדריץ'	DUO82007	פתרון חסימת Duolink, מגיע עם DUO92004 ו-DUO92002
אמצעי הרכבה עבור PLA	סיגמא-אולדריץ'	DUO82040	אמצעי הרכבה Duolink In Situ עם DAPI
מינוס בדיקה	סיגמא-אולדריץ'	DUO92004	Duolink In Situ Probe Anti-Mouse מינוס
בדיקת PLUS	סיגמא-אולדריץ'	DUO92002	Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
חיץ כביסה A	סיגמא-אולדריץ'	DUO82046	Duolink In Situ wash Buffer A
חיץ כביסה B	סיגמא-אולדריץ'	DUO82048	Duolink In Situ wash Buffer B
פולימראז	סיגמא-אולדריץ'	DUO82030	Duolink פולימראז, מגיע כחלק מהערכה האדומה Duolink In Situ Detection Reagents DUO92008
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי	לייקה		מצלמת DFC300G, מיקרוסקופ DM5500B
עז נגד עכבר Alexa 594	ג'קסוןאימונו	115-585-146	לשימוש בשעה 1:500
עז נגד ארנב Alexa 488	ג'קסוןאימונו	111-545-144	לשימוש בשעה 1:200
פיפטת זכוכית	קורנינג	7095B-5X
לבאמיסולה	ACROS אורגני	187870100	הכינו מלאי עבודה של 250mM
מתנול	פישר סיינטיפיק	A454
עכבר נגד FLAG	סיגמא	F1804	יש להשתמש בקנ"מ 1:1000 לטיפול באימונופלואורסנציה וב-PLA, לפני החסימה עם סרום עיזים רגיל
לק	צבעי לוס אנג'לס	צרפת
מדיום גידול נמטודות (NGM)	מגוון		ראה wormbook.org לפרוטוקול
סרום עיזים רגיל	ג'קסוןאימונו	005-000-121
פיפטה פוליאתילן פסטר	גלוב סיינטיפיק	135030
פולי-ל-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1524	מוכן כתמיסת מלאי של 0.1% במים, מאוחסן בטמפרטורה של -20C, ומדולל 1:100 במים כדי לצפות שקופיות
צלחות פטרי	טריטק	PD7060	קוטר 60 מ"מ
ארנב נגד GFP	תרמו פישר	G10362	יש להשתמש ב-1:200 עבור immunofluorescence, 1:4000 עבור PLA
שקופיות	תרמו פישר	30-2066A-בראון	שלוש שקופיות מרובעות בגודל 14x14 מ"מ הניתנות לסידור אוטומטי עם מוטות מוזמנות בהתאמה אישית באמצעות Fisher Scientific. פולי-L-ליזין נוסף לשקופיות במעבדה
תמיסת נתרן היפוכלוריט	פישר סיינטיפיק	SS290-1
מגבוני משימות	קימטק	34120	מגבוני משימות בגודל 4.4x8.4 אינץ'
מגשים (242x241x20 מ"מ)	תרמו פישר	240845	משמש להכנת חדר לח
טריטון X-100	ACROS אורגני	327372500
מים טהורים במיוחד	מילי-קיו		מים טהורים במיוחד המתקבלים ממערכת טיהור מים אינטגרלית Milli-Q
זכוכית שמירה	קרולינה ביולוגי	742300
-מקפיא 20°C
-80°C מקפיא
רדיד אלומיניום
זן OP50 E. coli
שייקר אורביטלי
קלטת
זני נמטודות ששימשו במחקר זה (שניהם זמינים לפי בקשה)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 נשף::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; OMA-1 נשף::OMA-1::GFP; הפניה 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 נשף סיום::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 נשף סיום::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); סימוכין: מחקר זה