1. משקעים חיסוניים
הערה: השתמשנו במאגר ליזה שאינו נתרן דודציל סולפט (SDS) ובהדבקת ציטראט, כמתואר בסעיפים הבאים. עם זאת, השימוש בטכניקת משקעים חיסוניים חלופית בתוך הבית עשוי להיות ישים גם להכנת דגימות LC-MS/MS.
- תאים בתרבית טרנספקט עם וקטורים המקודדים תג אפיטופ בלבד או חלבון היתוך. לקבלת נתונים מייצגים, העבר תאי J774 (1 x 106) עם וקטורים המקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בלבד או Capn6 (גן calpain-6) המאוחה GFP באמצעות ליפוזומים קטיוניים.
- נוגדנים מצומדים לחרוזים מגנטיים.
- למטרה זו, יש לערבב נוגדן אנטי-GFP (2 μL/תגובה) עם חרוזים מגנטיים (25 μL/תגובה) ב-500 μL של חיץ פוספט ציטראט (24.5 mM חומצת לימון, 51.7 mM דו-בסיסי נתרן פוספט; pH 5.0) במבחנה של 1.5 מ"ל.
- סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את החרוזים המצומדים ב-IgG שלוש פעמים עם חיץ פוספט ציטראט המכיל 0.1% פוליאוקסאתילן (20) סורביטן מונולאורט.
- Lyse את התאים הנגועים באמצעות מאגר ליזה מתאים. לקבלת נתונים מייצגים, ליז את התאים הנגועים במשך 30 דקות על קרח ב 400 μL של חיץ ליזה (50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.5% poly(oxyethelene) octylphenyl אתר) המכיל 40 μmol / L phenylmethylsulfonyl פלואוריד, 50 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, 50 מיקרוגרם / מ"ל aprotinin, 200 μmol / L נתרן orthovanadate, ו 1 mM אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA) ב 1.5 מ"ל מבחנות בדיקה 24 שעות לאחר transfection.
- נקה את הליזט על ידי צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 5 דקות ולאסוף את supernatant.
- הקדימו את הליזט. הוסף חרוזים מגנטיים ללא תווית (25 μL / תגובה) במבחנה של 1.5 מ"ל. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 500 μL של חיץ פוספט ציטראט. לאחר הסרת חיץ פוספט ציטראט בשטיפה הסופית, להוסיף את התא lysate מעל חרוזים מגנטיים. סובבו את התערובת באמצעות מסובב במהירות 50 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הניחו את המבחנה על מעמד מגנטי למשך 5 דקות לצורך הפרדה מגנטית, ואספו את הליזט של התא. מומלץ להשתמש במעמד המגנטי שנקבע על ידי היצרן.
- קשרו את חלבוני המטרה לחרוזים המצומדים. הניחו את החרוזים המצומדים אימונוגלובולין (Ig)G על מעמד מגנטי למשך 5 דקות לצורך הפרדה מגנטית, השליכו את מאגר הציטראט ולאחר מכן הוסיפו את הליזט התא לחרוזים המופרדים.
- סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- להפריד את חלבוני המטרה מחלבונים חופשיים שאינם חלבוני מטרה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים באמצעות 500 מיקרוליטר של חיץ פוספט ציטראט המכיל 0.1% פוליאוקסאתילן (20) סורביטן מונולאורט. לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו 30 מיקרוליטר של חיץ ציטראט (pH 2-3), ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפלוט את חלבוני המטרה.
הערה: אם ההתאוששות מהמשקעים החיסוניים אינה מספקת, השימוש בתגי אפיטופ חלופיים, כגון FLAG או HIS, עשוי לשפר את היעילות. אם יעילות האלוציה אינה מספקת, השימוש באלואנטים אחרים, כגון פתרון מבוסס SDS, עשוי לשפר את היעילות.
2. עיכול על הממברנה של חלבונים
הערה: שימוש בחומרים וציוד נטולי חלבון נחוץ כדי למנוע זיהום עם חלבונים אקסוגניים. בנוסף, מומלץ כי המפעיל ללבוש מסכה כירורגית וכפפות כדי למנוע זיהום על ידי חלבונים אנושיים.
- חתכו את קרומי PVDF לחתיכות בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיים שניגובו במתנול וייבשו מיד לפני השימוש.
- הוסיפו 2-5 מיקרוליטר אתנול לחתיכות קרום PVDF על רדיד אלומיניום נקי.
- לפני שהם מתייבשים לחלוטין, הוסיפו את הלואנט (2-5 מיקרוליטר כל אחד, 4-6 חתיכות לדגימה) על קרומי PVDF הידרופיליים, ולאחר מכן יבשו את הממברנות באוויר עד שפני השטח של הממברנה יהפכו למט. ממברנות מיובשות ניתן לאחסן ב 4 °C.
- מעבירים את כל הממברנות לתוך צינורות פלסטיק של 1.5 מ"ל, מוסיפים 20-30 מיקרוליטר אתנול כדי להפוך את הממברנות להידרופיליות, ולאחר מכן מסירים את האתנול באמצעות פיפטה.
- לפני שהממברנה מתייבשת לחלוטין, יש להוסיף 200 μL של תמיסת תגובה מבוססת dithiothreitol (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT ו-20% אצטוניטריל) ולדגור עליה ב-56°C למשך שעה אחת.
- החלף את תמיסת התגובה בתמיסת יודואצטמיד 300 מיקרוליטר (80 mM NH4HCO3, 55 mM iodoacetamide ו-20% אצטוניטריל), ודגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- לשטוף את הממברנות פעמיים עם 1 מ"ל של מים מזוקקים ופעם אחת עם 1 מ"ל של 2% acetonitrile על ידי ערבוב מערבולת במשך >10 שניות.
- יש להמיס טריפסין באיכות טרשת נפוצה (טבלת חומרים) ישירות בתמיסת התגובה (30 mM NH4HCO3 המכיל 70% אצטוניטריל). הוסף 100 μL של תמיסת התגובה המכילה 1 מיקרוגרם של טריפסין (טבלה של חומרים) (30 mM NH4HCO3 המכיל 70% acetonitrile) ולדגור ב 37 ° C במשך הלילה.
- העבר את תמיסת התגובה המכילה את העיכול הטריפטי למבחנה נקייה של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה.
- הוסף 100 μL של תמיסת שטיפה (70% acetonitrile / 1% חומצה trifluoroacetic) לממברנה ודגר אותו ב 60 ° C במשך 2 שעות. לאסוף את תמיסת הכביסה ולערבב אותו עם תמיסת התגובה. הוסף עוד 100 μL של תמיסת כביסה לממברנה ו sonicate אותו במשך 10 דקות. לאחר מכן לאסוף את תמיסת הכביסה ולערבב אותו עם פתרון התגובה.
- מכסים את המבחנה בחתיכת סרט מעבדה ועושים כמה חורים קטנים עם מחט. יבש את התמיסה באמצעות רכז ואקום.
- ממיסים את השאריות ב-10 מיקרוליטר של 0.2% חומצה פורמית. לאחר הצנטריפוגה (12,000 × גרם, 3 דקות בטמפרטורת החדר), מעבירים את הסופרנאטנט לצינור דגימה.
הערה: השטיפות הן השלבים הקריטיים של סעיף זה. במהלך עיכול חלבון על הממברנה, שטיפת הממברנות המכילות את החלבונים המשותקים לאחר הפחתה ואלקילציה במים מזוקקים, ואחריה 2% אצטוניטריל, במשך יותר מ -10 שניות כל אחד, היא קריטית להסרת הריאגנטים.
