$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הידרציה ביו-חיישנית והגדרת בדיקה
- הפעל את מכונת BLItz.
- ודא שההתקן מחובר למחשב באמצעות יציאת פלט נתונים מסוג USB בחלק האחורי של ההתקן.
- במחשב, פתח את התוכנה המשויכת (לדוגמה, BLItz Pro), ולחץ על Advanced Kinetics בצד שמאל של המסך.
- בתוכנה, הקלד את כל המידע המתאים על הניסוי (כולל שם הניסוי, תיאור, מזהה דגימה וריכוז חלבונים) תחת כל כותרת מתאימה.
- לחץ על Biosensor Type ובחר Ni-NTA מהתפריט הנפתח.
- תחת הכותרת הפעל הגדרות, ודא שה- Shaker מוגדר ל- Enable.
- תחת הכותרת רשימת סוג שלב, ודא שרשומים 5 פריטים: בסיס ראשוני, טעינה, קו בסיס, שיוך ודיסוציאציה.
הערה: ניתן לשנות את משך הזמן של כל שלב מברירת המחדל לפי הצורך. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במינימום של 30 שניות עבור 'תוכנית בסיסית ראשונית' ו'קו בסיס'; ו-120 שניות להתאגדות ודיסוציאציה. משך שלב ההעמסה (בין 120 ל-240 שניות) יהיה תלוי בריכוז הליגנד ובזיקה של תג ה-His-epitope על הליגנד ל-Ni-NTA-biosensor.
- הסר את הביו-חיישן Ni-NTA הלח מצינור ה-PCR והצמיד אותו לתושבת הביו-חיישן במכשיר על-ידי החלקת החלק הרחב של הביו-חיישן אל התושב.
הערה: אל תתנו לביו-חיישן להתייבש במהלך הניסוי.
- מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה שחור 0.5 מ"ל לתוך מחזיק הצינור של המכונה ופיפטה 400μL של חיץ BLI לתוכו.
- ודא שהמחוון של ההתקן ממוקם כך שמחזיק הצינור ממוקם לפני החץ השחור במכשיר.
- סגור את מכסה המכונה כך שקצה החיישן הביולוגי יהיה שקוע במאגר בצינור המיקרוצנטריפוגה.
- לחץ על הבא בתוכנה כדי להתחיל להקליט את הבסיס הראשוני.
2. העמסת ליגנד על ביוסנסור
- לאחר סיום ההקלטה של שלב הבסיס הראשוני, פתח את מכסה המכשיר.
- הזז את המחוון ימינה כך שמחזיק השחרור (במקום מחזיק הצינור) ימוקם לפני החץ השחור.
- פיפטה 4 μL של ליגנד מחויג His-tagged על מחזיק הטיפה ולסגור את המכסה של המכונה.
הערה: הריכוז האופטימלי של הליגנד שבו יש להשתמש עשוי להשתנות עבור כל חלבון. ריכוז בין 1.0 ל-2.0 מ"ג/מ"ל מספיק בדרך כלל כדי להרוות את נת"ע בקצה הביוסנסור ב-240 שניות.
- בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל בטעינה.
3. שטיפת ליגנד נוסף
- לאחר שלב הטעינה סיים את ההקלטה, פתח את מכסה המכשיר.
- הזז את המחוון שמאלה כך שמחזיק הצינור ימוקם שוב לפני החץ השחור.
- סגור את מכסה המכונה וודא שקצה החיישן הביולוגי שקוע במאגר ה- BLI של הצינור במחזיק הצינור
.
- לחץ על הבא שוב בתוכנה כדי להתחיל להקליט את קו הבסיס.
4. שיוך אנליטי לליגנד
- לאחר סיום ההקלטה של שלב הבסיס, פתח את מכסה המכשיר.
- הסר את מחזיק הטיפות ונקה אותו על ידי הוצאת כל חלבון ושטיפתו במים דה-יוניים כפולים (ddH2O) בסך הכל 5 פעמים.
- השתמשו במגבון טישו כדי לנקות את פני השטח של מחזיק הטיפות לאחר הכביסה.
- החלף את מחזיק הטיפה בחזרה למכשיר.
- הזז את המחוון במכשיר ימינה כך שמחזיק השחרור ימוקם שוב לפני החץ השחור.
- פיפטה 4 μL של אנליט מחויג על מחזיק הטיפה ולסגור את המכסה של המכונה.
- בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל שיוך.
5. דיסוציאציה של אנליט מליגנד
- לאחר ששלב ההתאגדות סיים את ההקלטה, פתח את עטיפת המכונה.
- הזז את המחוון במכונה ימינה כך שמחזיק הצינור ימוקם שוב לפני החץ השחור.
- בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל בדיסוציאציה.
- לאחר ששלב הדיסוציאציה סיים את ההקלטה, פתח את עטיפת המכונה.
- הסר את מחזיק הטיפות ואת מחזיק הצינורות.
- שטפו את שניהם עם ddH2O ביסודיות כדי לשטוף כל חלבון.
- הסר את החיישן הביולוגי והשלך אותו בבטחה.