$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת הדגימה: בדיקת ערבוב תאים-תאים
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הליך הערבוב עבור תאים דבקים. זה עשוי להיות שונה עבור תאים בתרבית בהשעיה.
- זרעו מספר מתאים של תאים על צלחת בת 6 בארות, למשל, 800,000 תאי HEK 293T (נספרים עם תא ספירה של נויבאואר), יום לפני הטרנספקציה. ניתן לשנות את המספר בהתאם לזמן שבין הזריעה לטרנספקציה ולהתאים אותו לסוגי תאים אחרים. כדי לבצע ניסוי בסיסי (כלומר, חלבונים בעלי עניין ובקרה שלילית), להכין לפחות 4 בארות. תאי תרבית בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 במדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco, בתוספת נסיוב בקר עוברי (10%) ו-L-גלוטמין (1%).
- תאים מדביקים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- כדי לבצע ניסוי בסיסי, טרנספקט, בבארות נפרדות, פלסמידים עבור החלבון המעניין התמזגו לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מונומרי (mEGFP), או חלבון פלואורסצנטי צהוב (mEYFP)) או חלבון פלואורסצנטי "אדום" (למשל, mCherry, או mCardinal) חלבון פלואורסצנטי.
הערה: בפרוטוקול זה, אנו מתמקדים ב-APLP1-mEYFP וב-APLP1-mCardinal, ובבקרה השלילית המתאימה, לדוגמה, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) ו-mCardinal (myr-palm-mCardinal). בדרך כלל, 200 ng - 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מספיק. יעילות העברה גבוהה מגדילה את הסיכוי למצוא תאים "אדומים" ו"ירוקים" במגע. שנה את כמות פלסמיד מגיב transfection כדי לייעל את יעילות transfection. ביקורתי: מפגש תאים צריך להיות סביב 70% בעת transfecting את התאים. אם התאים מתמזגים יתר על המידה, יעילות הטרנספקציה תרד. אם התאים אינם מתמזגים מספיק, טרנספקציה וערבוב עלולים לגרום ללחץ ולמנוע מתאים רבים התקשרות תקינה לאחר הערבוב.
- בצע ערבוב תאים ~ 4 ± שעתיים לאחר הטרנספקציה.
- הסירו את מדיום הגידול ושטפו היטב כל אחד מהם בעדינות עם 1 מ"ל PBS בתוספת Mg2+ ו-Ca2+. לאחר מכן, הסר את PBS. (קריטי) יש להפיל PBS על שפת הבאר כדי למנוע ניתוק תאים במהלך השטיפה.
- הוסף ~ 50 μL טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון טיפה חכם לכל באר כדי להקל על ניתוק של תאים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. לאחר מכן, נערו באיטיות את צלחת 6 הבארות לרוחב כדי לנתק את התאים.
הערה: זמני דגירה ארוכים עשויים להידרש עבור סוגי תאים מסוימים.
- הוסף 950 μL של מדיום גידול לכל באר והשהה מחדש תאים על ידי צנרת כמה פעמים למעלה ולמטה, ובכך לנתק את כל התאים מתחתית הבאר. (קריטי) ודא שהתאים מושעים מחדש כראוי ומנותקים זה מזה על ידי בדיקה חזותית של היעדר צברי תאים גדולים לאחר ההשעיה. אחרת, מגעים רבים 'אדומים'-'אדומים' או 'ירוקים'-'ירוקים' יתקבלו לאחר הערבוב.
- העבר את תמיסת התא של באר אחת (חלבון בעל עניין או בקרה שלילית) לבאר המתאימה, כלומר תאים "אדומים" (למשל, APLP1-mCardinal transfected) לתאים "ירוקים" (למשל, APLP1-mEYFP transfected). מערבבים בעדינות כמה פעמים למעלה ולמטה. לאחר מכן, זרעו את התאים המעורבים על כלים תחתונים מזכוכית בקוטר 35 מ"מ (1 מ"ל של תמיסת תאים מעורבים לכל מנה, בתוספת 1 מ"ל של מדיום גידול) ותרבו תאי זרעים ליום נוסף בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
2. הכנת הדגימה: בקרה חיובית לניסויי מתאם צולב ומבנה הומו-דימר לניתוח בהירות
- זרעו 600,000 תאי HEK 293T, שנספרו עם תא ספירת תאים, על צלחות תחתיות זכוכית בקוטר 35 מ"מ יום לפני ההדבקה. תרבית את התאים ב 37 ° C, 5% CO2 בתווך DMEM מלא (ראה שלב 1.1) ליום נוסף.
- תאים Transfect עם ~ 250 ng של DNA פלסמיד על פי הוראות היצרן. עבור בקרת מתאם צולב חיובי, השתמש פלסמיד המקודד חלבון פלואורסצנטי מעוגן קרום hetero-dimer, למשל, myr-palm-mCherry-mEGFP או myr-palm-mCardinal-mEYFP המתאים FPs של חלבון עניין. לכיול בהירות, השתמש בפלסמידים המקודדים הן מונומר FP מעוגן קרום והן הומו-דימר המתאים ל- FPs המאוחים לחלבון המעניין, לדוגמה, myr-palm-mEYFP ו- myr-palm-mEYFP-mEYFP כדי לכייל את ניתוח הבהירות של APLP1-mEYFP.
- תאי תרבית ב 37 ° C, 5% CO2 בתווך DMEM מלא (ראה שלב 1.1) ליום אחר.
3. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי: הגדרה וכיול נפח מוקד
הערה: הפרוטוקול הבא נכתב עבור ניסויים שבוצעו עם mEGFP/mEYFP ו-mCherry/mCardinal במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ששימש במחקר זה. ניתן לשנות את ההגדרה האופטית, הגדרות התוכנה (קווי לייזר, מראות דיכרואיות, מסננים) ובחירת צבעי הכיול עבור הגדרות FPs ומיקרוסקופ אחרות.
- הפעל את המיקרוסקופ והלייזרים לפחות שעה לפני הניסוי כדי להבטיח יציבות לייזר ושיווי משקל של טמפרטורה.
- הכינו 100-200 מיקרוליטר של תמיסות צבע פלואורסצנטיות מסיסות במים מתאימות (ראו טבלת חומרים לדוגמה) במים או PBS כדי לכייל את נפח המוקד, בריכוזים בטווח של 10-50 ננומטר.
- הניחו את תמיסות הצבע על צלחת תחתונה נקייה מזכוכית 35 מ"מ #1.5, כלומר, בעלת עובי של 0.16-0.19 מ"מ.
הערה: באופן אידיאלי, השתמש בכלים עם זכוכית כיסוי בעלת ביצועים גבוהים בעלי סובלנות עובי נמוכה, למשל, 0.170 ± 0.005 מ"מ, המאפשר תיקון טבעת צווארון אופטימלי (שלב 3.6). חשוב להשתמש באותו סוג של צלחת כפי שנעשה בה שימוש מאוחר יותר עבור הניסויים הבאים.
- הניחו את הכלי המכיל את תמיסת הצבע ישירות על המטרה (רצוי טבילה במים, עם NA 1.2) כדי להבטיח מיקוד בתמיסה. לחלופין, הניחו את המנה על מחזיק הדגימה והתמקדו בדגימה (למשל, 10-20 מיקרומטר מעל תחתית המנה).
הערה: איננו ממליצים להשתמש במטרות שמן בשל האות הלקוי המתקבל בעת התמקדות עמוקה לתוך דגימות מימיות.
- הגדר את נתיב העירור והפליטה, לדוגמה, בחר לייזר 488 ננומטר, מראה דיכרואית 488/561 ננומטר, חלון גילוי 499-552 ננומטר, וגודל חור סיכה של יחידה אוורירית אחת (AU). ודא שגודל חור הסיכה זהה לזה שישמש במדידות מתאם צולב.
- התאימו את מיקום חור הסיכה (התאמת חור הסיכה) ואת טבעת הצווארון האובייקטיבית כדי למקסם את קצב הספירה. למטרה זו, סובב את טבעת הצווארון עד לזיהוי קצב הספירה המרבי.
הערה: תיקון טבעת הצווארון לוקח בחשבון את העובי הספציפי של זכוכית הכיסוי בה נעשה שימוש. מקסום קצב הספירה, כלומר איסוף פוטונים רבים ככל האפשר למולקולה, חיוני למקסום יחס האות לרעש (SNR) של המדידות.
- בצע סדרה של מדידות FCS נקודתיות (למשל, 6 מדידות במיקומים שונים, שכל אחת מהן מורכבת מ-15 חזרות של 10 שניות, כלומר 2.5 דקות זמן כולל, שנדגמו עם זמן שהייה של 1 μs או פחות) באותה עוצמת לייזר שבה נעשה שימוש במדידות מתאם צולב (בדרך כלל ~1%, כלומר ~1-2 μW).
- התאמת מודל דיפוזיה תלת-ממדי הכולל תרומה משולשת (משוואה 1) לנתונים.
הערה: בדרך כלל, זמני הדיפוזיה המתקבלים הם סביב 30 μs וגורם המבנה הוא סביב 4-8.
- חישוב המותניים w0 מזמן הדיפוזיה הממוצע הנמדד והערכים שפורסמו עבור מקדם הדיפוזיה של הצבע המשומש בטמפרטורת החדר לפי משוואה 2.
ערכים אופייניים הם 200-250 ננומטר.
- חזור על שגרת הכיול (שלבים 3.4-3.9) עם צבע פלואורסצנטי שונה לערוץ גילוי שני במידת הצורך (למשל, עירור 561 ננומטר וזיהוי בין 570 ננומטר ל- 695 ננומטר). שמור על המיקום והגודל של חור הסיכה כפי שהוגדרו עבור ערוץ הזיהוי הראשון.
- חשב את הבהירות המולקולרית (משוואה 3) ממדידות הכיול, ואחסן את הערכים המתקבלים.
הערה: ערכים אופייניים עבור ההתקנה בשימוש הם ~ 8-10 kHz / מולקולה (MOL) עבור 1.8 μW 488 ננומטר כוח עירור. ערכים נמוכים מהרגיל עשויים להצביע על לכלוך על המטרה, חוסר יישור של ההתקנה או תפוקת לייזר מופחתת. בדוק ואחסן את עוצמת יציאת הלייזר במטרה באופן קבוע באמצעות מד הספק. לצורך השוואה בין תצורות שונות, בהירות מולקולרית המנורמלת על ידי עוצמת לייזר העירור היא הפרמטר המשמעותי ביותר להערכת ביצועי המיקרוסקופ.
4. סריקת ספקטרוסקופיית מתאם צולב פלואורסצנטית: רכישה
הערה: הפרוטוקול הבא נכתב עבור ניסויים שבוצעו עם mEGFP/mEYFP ('ירוק') ו-mCherry/mCardinal ('אדום') במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר ששימש במחקר זה. ההגדרה האופטית והגדרות התוכנה (קווי לייזר, מראות דיכרואיות, מסננים) עשויות להיות שונות עבור הגדרות FP או מיקרוסקופ אחרות.
- הגדר את הנתיב האופטי, לדוגמה, עירור 488 ננומטר ו- 561 ננומטר ומראה דיכרואית 488/561 ננומטר, חור סיכה על 1 AU לעירור 488 ננומטר. כדי להימנע מדיבור צולב ספקטרלי, בחר שתי רצועות נפרדות כדי לעורר ולזהות mEGFP/mEYFP (עירור 488 ננומטר, ערוץ ירוק) ו- mCherry/ mCardinal (עירור 561 ננומטר, ערוץ אדום) ברצף ובחר רצועות מתג בכל שורה. לצורך האיתור, השתמש במסננים מתאימים לשני הערוצים, לדוגמה, 499-552 ננומטר בערוץ הירוק ו- 570-695 ננומטר בערוץ האדום.
- אם עירור לסירוגין אינו אפשרי, השתמש בהגדרות מסנן מתאימות עבור הערוץ האדום כדי למזער דיבור צולב ספקטרלי (כלומר, לזהות פלואורסצנטיות mCherry/mCardinal שאינה נמוכה מ- 600 ננומטר). זה עשוי להפחית את כמות הפוטונים המתגלים בתעלה האדומה ובכך להפחית את SNR.
- מניחים את המנה המכילה את התאים המעורבים על מחזיק הדגימה. המתן לפחות 10 דקות כדי להבטיח איזון טמפרטורה ולהפחית את סטיית המיקוד.
- התמקד בתאים באמצעות נורית השידור בתפריט Locate (אתר).
- חפש זוג תאים 'אדומים' ו'ירוקים' הבאים במגע זה עם זה. עבור בקרת המתאם הצולב, או בקרת הבהירות של הומו-דימר (ראה סעיף 2), חפש תא מבודד הפולט פלואורסצנטיות בשני הערוצים או את אות ההומו-דימר המתאים ב- PM.
הערה: (קריטי) צמצם את חשיפת הדגימה בעת חיפוש תאים כדי למנוע טרום-הלבנה, מה שעשוי להפחית את הקורלציה הצולבת. לכן, סרוק במהירות הסריקה הגבוהה ביותר ובעוצמת לייזר נמוכה. כדי למנוע רוויית גלאי בזמן הדמיה של תאים המבטאים תאים חזקים, חפש במצב אינטגרציה. עם זאת, כדי למזער את החשיפה, סריקה בעוצמות לייזר נמוכות יותר אפשרית במצב ספירת פוטונים.
- בחר נתיב סריקה בניצב למגע בין תא לתא (או ל- PM של תא בודד עבור בקרת המתאם הצולבות החיובי או בקרת בהירות הומו-דימר) באמצעות לחצן חיתוך כמתואר באיורים 1B ו- 2A.
הערה: חלק מהמיקרוסקופים הישנים אינם מאפשרים הוראות סריקה שרירותיות. במקרה זה, יש לאתר מגעים של תאים עם כיוון מאונך לכיוון הסריקה.
- שנה גודל תצוגה כדי להשיג גודל פיקסלים של 50-200 ננומטר ובחר קו במצב סריקה. הגדר את גודל המסגרת ל- 128 × 1 pixels.
הערה: גודל פיקסלים אופייני הוא 160 ננומטר, המתאים לאורך סריקה של כ-20 מיקרומטר.
- הגדר את מהירות הסריקה לערך המרבי המותר, לדוגמה, 472.73 μs לשורה.
הערה: עבור ערכת עירור חלופית, זה מתאים לזמן סריקה של 954.45 μs, כלומר ~ 1000 סריקות לשנייה בהתקנה בשימוש. ניתן להתאים את מהירות הסריקה בהתאם למקדם הדיפוזיה של החלבון המעניין. עבור חלבונים מעוגני קרום, זמני הדיפוזיה האופייניים הם סביב 10-20 אלפיות השנייה. זמן הסריקה צריך להיות קטן לפחות פי עשרה מזמני הדיפוזיה. מהירויות סריקה נמוכות יותר עשויות לגרום להלבנה חזקה יותר ולדרוש עוצמת תאורה נמוכה יותר. לחלופין, ניתן להטיל הפסקה, למשל 5 אלפיות השנייה, בין כל סריקה עבור קומפלקסים המתפזרים לאט מאוד באמצעות מרווח בתפריט המשנה של סדרת הזמן.
- בחר את כוחות הלייזר המתאימים, למשל, ~ 1-2 μW עבור 488 ננומטר ו~ 5-10 μW עבור עירור 561 ננומטר.
הערה: עוצמת לייזר גבוהה יותר משפרת את ה-SNR, אך מגבירה את ההלבנה. לכן, יש לבחור בכוחות לייזר כך שההלבנה תהיה פחות מ-50% מקצב הספירה הראשוני .
- הגדר מחזורים ל- 100,000-500,000.
הערה: מספר הסריקות, כלומר משך המדידה, עשוי להשתנות: זמני מדידה ארוכים יותר ישפרו את SNR ועשויים להתאים יותר לפיזור איטי של מולקולות, אולם תנועת התאים וההלבנה מגבילים את זמן המדידה המקסימלי. הנתונים המוצגים כאן נרכשו באופן שגרתי במשך ~3-6 דקות, כלומר 200,000-400,000 סריקות קווים.
- הגדר גלאים למצב ספירת פוטונים. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישה. חזור על שלבים 4.5-4.11 כדי למדוד תא אחר.
הערה: מומלץ למדוד 10-15 תאים לדגימה ברמות ביטוי שונות. (קריטי) הימנע מרוויה של הגלאי ברמות ביטוי גבוהות. קצב הספירה המרבי לא יעלה על ~1 MHz.
- אם מתבצע ניתוח בהירות לקביעת מצבים אוליגומריים, בצע מדידות כיול בהירות הומו-דימר בהתאם לשלבים 4.1-4.11 ששונו: למדוד כל חלבון פלואורסצנטי הומו-דימר בנפרד (בתאים מבודדים, שהוכן באמצעות פרוטוקול סעיף 2) ולבצע מדידות רק בערוץ ספקטרלי אחד.
