בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

תקציר

מקור: Strazza, M., et al. Co-immunoprecipitation Assay לחקר אינטראקציות תפקודיות בין קולטנים ואנזימים. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה לביצוע משקעים חיסוניים משותפים של חלבוני PD-1 מסוג פרא המתויגים כ-GFP ומוטציה PD-1 באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד GFP. חלבוני PD-1-GFP הקשורים לחרוזים מודגרים עם חלבוני SHP2 המקיימים אינטראקציה עם PD-1, ומאפשרים זיהוי מוטיבים מבניים ספציפיים ב-PD-1 הממלאים תפקיד קריטי באינטראקציה עם SHP2.

פרוטוקול

1. משקעים חיסוניים

הערה: יש לבצע את השלבים הבאים על קרח או בטמפרטורה של 4°C (75 °F).

1. השלם את מאגר הליזה (50 mM Tris-HCl ב- pH 7.2, 250 mM NaCl, 0.1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% גליצרול) עם מעכבי פרוטאז (להמיס טבליה אחת ב 10 מ"ל של מאגר ליזיס) ועם 1 mM נתרן orthovanadate. הוסף 500 μL של חיץ ליזה קר כקרח לתאים והסר ואסוף את התאים מהלוחות באופן מיידי באמצעות מגרד תאים.
   הערה: חשוב להוסיף את הנתרן האורתוונדאט רק למאגר הליזיס שישמש עבור הלוחות הנגועים PD-1-GFP מכיוון שהלוחות הנגועים SHP2 ולוחות הבקרה שאינם נגועים חייבים לשמור על פעילות פוספטאז.
2. מעבירים את הליזטים לתוך צינורות קרים של 1.5 מ"....

תוצאות

איור 1: תנאי ניסוי ואסטרטגיה. GFP-PD-1 WT (סוג פראי), GFP-PD-1 Y223F (מוטנט ITIM), או GFP-PD-1 Y248F (מוטנט ITSM) באו לידי ביטוי בתאי HEK 293T שטופלו לאחר מכן בפרוואנדט. חלבוני GFP-PD-1 שנאספו על ידי משקעים חיסוניים של GFP עורבבו עם ליזטים מתאים בעלי ביטוי יתר של SHP2, ותועדו הרמות והפעילות של SHP2 הקשור לכל גרסה של PD-1.

....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ממברנות ניטרוצלולוז	ג'נרל אלקטריק	10600004
מיקרוצנטריפוגה	אפנדורף	5424-R	1.5 מ"ל
BCA	פישר	23225	בדיקת חומצה צינצ'ונינית Bi
אנטי-SHP2	סנטה קרוז	SC-280
אנטי-GFP-אגרוז	MBL	D153-8
אנטי-GFP	רוש	118144600
אנטי אקטין	סנטה קרוז	SC-1616
תאי HEK-293	ATCC	CRL-1573
אורתובנדאטה	סיגמא	S6508
קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	11836170001	ללא EDTA
מאגר דגימת Tris-Glycine SDS (2x)	Invitrogen	LC2676	מאגר Laemmli שונה
4-20% ג'לים קטנים Tris-Glycine	Invitrogen	XP04205BOX	15 באר
טריפסין-EDTA (0.25%) פנול אדום	גיבקו	25200114
NaCl	סיגמא	S7653	נתרן כלורי