בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

תקציר

מקור: Strazza, M., et al. Co-immunoprecipitation Assay לחקר אינטראקציות תפקודיות בין קולטנים ואנזימים. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה לביצוע משקעים חיסוניים משותפים של חלבוני PD-1 מסוג פרא המתויגים כ-GFP ומוטציה PD-1 באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד GFP. חלבוני PD-1-GFP הקשורים לחרוזים מודגרים עם חלבוני SHP2 המקיימים אינטראקציה עם PD-1, ומאפשרים זיהוי מוטיבים מבניים ספציפיים ב-PD-1 הממלאים תפקיד קריטי באינטראקציה עם SHP2.

פרוטוקול

1. משקעים חיסוניים

הערה: יש לבצע את השלבים הבאים על קרח או בטמפרטורה של 4°C (75 °F).

1. השלם את מאגר הליזה (50 mM Tris-HCl ב- pH 7.2, 250 mM NaCl, 0.1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% גליצרול) עם מעכבי פרוטאז (להמיס טבליה אחת ב 10 מ"ל של מאגר ליזיס) ועם 1 mM נתרן orthovanadate. הוסף 500 μL של חיץ ליזה קר כקרח לתאים והסר ואסוף את התאים מהלוחות באופן מיידי באמצעות מגרד תאים.
   הערה: חשוב להוסיף את הנתרן האורתוונדאט רק למאגר הליזיס שישמש עבור הלוחות הנגועים PD-1-GFP מכיוון שהלוחות הנגועים SHP2 ולוחות הבקרה שאינם נגועים חייבים לשמור על פעילות פוספטאז.
2. מעבירים את הליזטים לתוך צינורות קרים של 1.5 מ"ל ומסובבים אותם ב 0.005 x גרם, 4 ° C למשך 30 דקות.
3. כדי לאסוף את הסופרנאטנט של גרעיני הפוסט (PNS) מהליזטים, סובבו את הליזאטים במשך 10 דקות ב-10,000 x גרם ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים. השליכו את הכדור. אחסנו את הסופרנאטנטים של הקבוצה השנייה של שש צלחות (איור 1) על קרח לצורך ניתוח מאוחר יותר של ליזט של תאים שלמים.
4. הכנת חרוזי אנטי-GFP למשקעים חיסוניים של PD-1-GFP מליזטים נגועים PD-1-GFP של הקבוצה הראשונה (ארבע לוחות) (איור 1).
   1. כדי למנוע את שקיעת החרוזים, נערו בעדינות את הבקבוק עם החרוזים לפני הפתיחה. הסר 40 μL של חרוזים נגד GFP מן slurry לכל מצב.
   2. סובבים ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant כדי לשטוף את החרוזים.
      הערה: חשוב למזער את המגע בין קצות הפלסטיק פיפטה וחרוזי אגרוז כדי למנוע אובדן. מומלץ לחתוך את הקצה של קצה 200 μL לפני העברת החרוזים לצינור אחר.
   3. להשעות מחדש את החרוזים ב 80 μL של חיץ ליזה (לכל דגימה).
5. הוסף את החרוזים השטופים ישירות לתא ליזט (PNS) מהתאים המבטאים PD-1-GFP של הקבוצה הראשונה (ארבעה לוחות) (שלב 1.3). סובב ב- 0.005 x גרם במשך 30 דקות ב- 4 ° C כדי לזרז את החלבונים המתויגים ב- GFP.
6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של חיץ ליזה קר (ללא orthovanadate) 3 פעמים. צנטריפוגה את הצינור ב 2,500 x גרם עבור 10 s.
   הערה: בעת הוספת חיץ הליזיס לחרוזים, הוסיפו אותו ישירות על החרוזים מבלי לגעת בהם עם הקצות. אין צורך בפייטה למעלה ולמטה במהלך השטיפות.
7. באופן שווה, חלקו את הליזט של SHP2 הפעיל מהסט הראשון (צלחת אחת; שלב 1.3) והוסיפו אותו לשלוש שפופרות של החרוזים השטופים המכילים PD-1-GFP (WT PD-1-GFP ושתי המוטציות השונות חסרות הזרחן, Y223F ו-Y248F). הוסף שליש מהנפח מהליזט של התאים שאינם נגועים לצינור השני של חרוזי WT PD-1-GFP. מחק את שני השלישים הנותרים.
8. לדגור את החרוזים במשך 4 שעות ב 4 ° C עם סיבוב עדין (0.005 x גרם).
9. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ ליזה קר (ללא pervanadate או orthovanadate), כפי שדווח בשלב 1.6.
10. הוסף 80 μL של חיץ ליזיס (ללא pervanadate או orthovanadate) לכל דגימה, וודא שהנפח הכולל בכל צינור הוא 100 μL (20 μL של חרוזים ו- 80 μL של חיץ ליזיס). מערבבים בעדינות ומעבירים 50 μL מכל צינור לשני צינורות טריים של 1.5 מ"ל.
    הערה: לאחר שלב זה, יהיו שני צינורות מלאים בתערובת המכילה חרוזים וחיץ ליזיס. אחד הצינורות ישמש לבדיקת SHP2 המשולב על ידי כתם מערבי.

2. ניתוח כתם מערבי SHP2

1. סובבו את החרוזים והסירו את הסופרנטנט.
2. מוסיפים 20 μL של 2x Laemmli buffer (ראו טבלת חומרים) לחרוזים ומרתיחים ב-95°C למשך 5 דקות.
3. מדוד את ריכוז החלבון של פקדי הקלט (קבוצה שנייה) באמצעות ערכת BCA (ראה טבלת חומרים). מעבירים 30 μL של הדגימה המדוללת ביותר לצינור חדש. לדלל את שאר פקדי הקלט עם חיץ ליזיס לאותו ריכוז כמו הדגימה המדוללת ביותר ולהעביר 30 μL מכל אחד מהם לצינור חדש.
   הערה: לאחר שלב זה, יהיו 4 צינורות עם 30 μL כל אחד, בריכוזי חלבון דומים, המייצגים את בקרות הקלט lysates.
4. הוסיפו לליזטים נפח שווה של 2x חיץ Laemmli והרתיחו בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות. סובבו את החרוזים כלפי מטה והעמיסו את הסופרנאטנט על ג'ל מבוסס תריס SDS-PAGE 4-20% (ראו טבלת חומרים) לניתוח כתמים מערביים. בנוסף, לטעון 50 μL מכל מדגם של הקבוצה השנייה.
5. המשך עם ניתוח כתמים מערביים.

תוצאות

איור 1: תנאי ניסוי ואסטרטגיה. GFP-PD-1 WT (סוג פראי), GFP-PD-1 Y223F (מוטנט ITIM), או GFP-PD-1 Y248F (מוטנט ITSM) באו לידי ביטוי בתאי HEK 293T שטופלו לאחר מכן בפרוואנדט. חלבוני GFP-PD-1 שנאספו על ידי משקעים חיסוניים של GFP עורבבו עם ליזטים מתאים בעלי ביטוי יתר של SHP2, ותועדו הרמות והפעילות של SHP2 הקשור לכל גרסה של PD-1.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ממברנות ניטרוצלולוז	ג'נרל אלקטריק	10600004
מיקרוצנטריפוגה	אפנדורף	5424-R	1.5 מ"ל
BCA	פישר	23225	בדיקת חומצה צינצ'ונינית Bi
אנטי-SHP2	סנטה קרוז	SC-280
אנטי-GFP-אגרוז	MBL	D153-8
אנטי-GFP	רוש	118144600
אנטי אקטין	סנטה קרוז	SC-1616
תאי HEK-293	ATCC	CRL-1573
אורתובנדאטה	סיגמא	S6508
קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	11836170001	ללא EDTA
מאגר דגימת Tris-Glycine SDS (2x)	Invitrogen	LC2676	מאגר Laemmli שונה
4-20% ג'לים קטנים Tris-Glycine	Invitrogen	XP04205BOX	15 באר
טריפסין-EDTA (0.25%) פנול אדום	גיבקו	25200114
NaCl	סיגמא	S7653	נתרן כלורי