שיטה מבוססת ELISA לניתוח אינטראקציות בין חלבוני פיתיון וטרף

Abstract

מקור: Singh, B. et al., Assays for Study the role of Vitronectin in Bacterial Adfusion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר טכניקה מבוססת ELISA המזהה אינטראקציות חלבון-חלבון בין שני חלבונים על ידי מדידת הקישור של החלבון השני לחלבון הראשון המשותק. החלבון השני המאוגד מזוהה באמצעות נוגדנים ספציפיים המסומנים באנזים, כגון חזרת פרוקסידאז.

Protocol

1. ניתוח ELISA של האינטראקציה בין PH רקומביננטי ו- Vn

הערה: יש לכלול פקדים כדי לא לכלול איגוד לא ספציפי. גורם אנושי H (FH) או חלבון קושר C4b (C4BP) משמשים כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה.

1. דללו כל אחד מהחלבונים האנושיים (Vn, FH ו-C4BP) בנפרד ל-50 ננומטר ב-Tris-HCl, pH 9.0 (מאגר ציפוי). יש לפזר 100 מיקרוליטר של תמיסת חלבון לכל באר של צלחת מיקרוטיטר פוליסורפ. סגור את הצלחות עם המכסה ואחסן אותם ב 4 ° C למשך הלילה (16 שעות) כדי להקל על אימוביליזציה של חלבון על בארות צלחת microtiter.
2. השליכו את התמיסה מצלחת המיקרוטיטר על ידי הטייתה, הפוך מעל הכיור, ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBS/באר. חסום את הבארות המצופות למשך שעה אחת ב- RT עם PBS המכיל 2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
3. לאחר הסרת פתרון החסימה, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 300 μL של PBS המכיל 0.05% (v/v) Tween 20 (PBST) לכל באר. הוסף 100 μL של 50 ננומטר רקומביננטי His-tagged PH לכל דגימה היטב ודגר במשך שעה אחת ב- RT. בבארות בקרה, להוסיף רק 100 μL של PBS-BSA.
   הערה: הגן lph המקודד PH מ-Hif הוגבר על ידי PCR ושוכפל לווקטור הביטוי pET26b המוסיף תג 6× שלו ב-C-terminus של החלבון המבוטא. הווקטור הרקומביננטי הפך ל- E. coli BL21(DE3) לביטוי. שרף Ni-NTA שימש לטיהור החלבון הרקומביננטי.
4. השליכו את תמיסת החלבונים והוציאו את החלבונים הלא קשורים על ידי שטיפת הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBST לכל באר. הוסף 100 μL של PBS-BSA המכיל חזרת peroxidase (HRP) מצומד נגד pAbs שלו (דילול 1:10,000) ודגור במשך 1 שעה ב RT.
5. הכן 20 mM פתרון A על ידי המסת tetramethylbenzidine בתמיסה של 5% אצטון ו 45% מתנול. להכנת תמיסה B, יש להמיס 19.2 גרם חומצת לימון ב-1,000 מ"ל של H₂O, להתאים את ה-pH ל-4.25 על ידי הוספת KOH, ואז להוסיף 230 μL של 30% H₂O₂. אחסן את שני הפתרונות בחושך ב- RT. ממש לפני השימוש, מערבבים 500 μL של תמיסה B עם 9.5 מ"ל של תמיסה A כדי להכין את מגיב זיהוי ELISA.
6. לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 μL של PBST לכל באר ולזהות מתחמי נוגדנים אנטיגן על ידי הוספת 100 μL של מגיב זיהוי ELISA לכל באר.
7. הוסף 50 μL של 1 M H₂SO₄/well כדי לעצור את התגובה. מדוד את הצפיפות האופטית של הבארות ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חיישני AR2G	פאל מדעי החיים	18-5095	חיישן לחלבון משותק על ידי צימוד אמינו
אצטון	VWR	97064-786	ציון ניתוח
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A2058	מתאים לתרבית תאים
C4BP (חלבון קושר C4b)	Complement טכנולוגיה, Inc.	A109	נקנה בצורת נוזל קפוא
חומצת לימון	סיגמא-אולדריץ'	251275-500 גרם	ציון האגודה האמריקאית לכימיה (ACS)
נוגדנים מצומדים נגד התיוג שלו	אבקאם	dorit_1999	רב-שבטי
C4BP	Complement טכנולוגיה, Inc.	A109	תמיסה קפואה
עמודת שרף זיקה היסטידין (HisTrap HP)	GE Health Care מדעי החיים	17-5247-01	עמודים ארוזים מראש עם Ni Sepharose
PH המתויג שלו			מבוטא ומטוהר באופן רקומביננטי במעבדה שלנו
מתאנו	VWR	BDH1135-1LP	ציון ניתוח
פלסמיד המכיל C-terminal 6x His-tag בעמוד השדרה (pET26(b))	נובאגן	69862-3	וקטור DNA
צלחות מיקרוטיטר פוליסורב	סיגמא-אולדריץ'	M9410	עבור ELISA
טטרמתילבנזידין	סיגמא-אולדריץ'	860336-100 מ"ג	כיתה אליסה
ויטרונקטין (Vn) מפלזמה אנושית	סיגמא-אולדריץ'	V8379-50UG	כיתה בתרבית תאים