בדיקת ביוסנסור מוליך מבוססת β-לקטמאז לאינטראקציות חלבון-חלבון

תקציר

מקור: Vandevenne, M., et al. The Use of a β-lactamase based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים בדיקת ביוסנסור מוליך כדי לחקור את האינטראקציה של נוגדן עם אנטיגן מטרה משותק על שבב מתמר. הביוסנסור מהונדס כך שיהיה לו חלבון כימרי דו-תפקודי – אנזים β-לקטמאז עם אתר קטליטי פונקציונלי המאוחה לננון לצורך קשירה לאנטיגן המטרה המשותק. עם הקשירה, ההידרוליזה הקטליטית של מצע אנטיביוטי על ידי האנזים β-לקטמאז מייצרת אות חשמלי - המאשר את האינטראקציה בין אנטיגן לנוגדן.

פרוטוקול

1. הכנת דגימת חלבון

1. לייצר ולטהר את החלבון ההיברידי BlaP-cAb-Lys3 כפי שדווח במחקר הקודם שלנו. אחסן את החלבון ב 50 mM פוספט buffer pH 7.4 עם ההרכב הבא: 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na₂HPO₄ ו 0.24 גרם של KH₂PO₄ מומס 800 מ"ל של מים מזוקקים תקן את ה- pH של התמיסה ל 7.4 לפני התאמת הנפח הסופי של התמיסה ל 1 L. מסנן לעקר את תמיסת החלבון.
2. הכינו תמיסת ציר ליזוזים חלבון ביצת תרנגולת (HEWL). להמיס 100 מ"ג (40,000 יחידות / מ"ג) של HEWL שנרכש מסחרית ב 10 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS ראה שלב 2.1.1). לעקר את תמיסת החלבון על ידי סינון באמצעות מסננים עם חיתוך 0.22 מיקרומטר.

2. בדיקות Biosensor

1. הכנת תמיסה וחיץ
   1. הכן PBS של 50 mM על ידי המסת 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na₂HPO₄, ו- 0.24 גרם של KH₂PO₄ ב 800 מ"ל של מים מזוקקים. יש לכוונן ל-pH 7.4 עם 1 N HCl או 1 N NaOH לפני התאמת נפח התמיסה ל-1 L. יש לסנן-לעקר ולאחסן ב-4°C.
   2. הכינו תמיסת רוויה/חסימה על ידי המסת 3 גרם קזאין הידרוליזה ב-100 מ"ל PBS שהוכנו כמתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   3. הכן תמיסת קישור על ידי המסת 1 גרם של קזאין הידרוליזה ב 100 מ"ל של PBS מוכן כמתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   4. הכינו תמיסת כביסה (0.1% טווין - PBS) על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של טווין 20 (100%) ב-100 מ"ל PBS שהוכנו כמתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   5. הכן תמיסת הכנת אלקטרודות (1% Triton X-100 - PBS) על ידי הוספת 1 מ"ל של Triton X-100 (100%) ב- 100 מ"ל PBS שהוכן כמתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   6. הכינו תמיסת רגנרציה של אלקטרודות (3.5 M KCl) על ידי המסת 26 גרם KCl במים מזוקקים לנפח סופי של 100 מ"ל. יש לסנן מעוקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   7. הכן תמיסת NaCl של 5 mM על ידי המסת 0.29 גרם NaCl במים מזוקקים לנפח סופי של 1 L. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. לאחר מכן, להכין פתרון זיהוי (4 mM benzylpenicillin) על ידי המסת 26.7 מ"ג של benzylpenicillin ב 20 מ"ל של 5 mM NaCl פתרון. יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
2. הכנת חיישנים והתחדשות
   הערה: שבבי החיישנים מצופים הפוליאנילין פותחו וסופקו באדיבות על ידי ד"ר פ. בוגארטס, ד"ר ס. יונוס ופרופ' י. גלופצ'ינסקי (האוניברסיטה הקתולית של לוביין-לה-נב - CHU Mont-Godinne). תיאור החיישן, כמו גם פרוטוקולי אלקטרו-פילמור פוליאנילין המשמשים לסנתוז חיישנים אלה מפורטים בעבודתם הקודמת. בקצרה, מערכת זו משתמשת בחיישנים לשימוש חוזר של שמונה שבבים בודדים שיוצרו בטכניקות קלאסיות של מעגלים מודפסים (PCB). שבבים בודדים מורכבים משלוש נקודות עגולות אלקטרודה. העליון הוא אלקטרודת העבודה שעליה פוליאנילין היה אלקטרו-סינתזה. האמצעית היא אלקטרודת הייחוס והאלקטרודה התחתונה מהווה את האלקטרודה הנגדית. שניהם, הייחוס והאלקטרודות הנגדיות מתפקדים באמצעות אמלגם Ag/AgCl מוצק על גבי שכבת הפחמן.
   1. בצע 3 שטיפות של האלקטרודות על ידי טבילת הקצוות לתוך בארות של צלחת 96 בארות המכילה 300 μL / באר של תמיסת הכנת אלקטרודות (1% Triton X-100 - PBS, ראה שלב 2.1.5). בצעו כל כביסה במשך 2 דקות בערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את האלקטרודות על ידי טבילת הקצוות בבארות של צלחת 96 בארות המכילה 300 מיקרוליטר/באר מים מזוקקים למשך 2 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
   3. לחדש את האלקטרודות על ידי טבילת הקצוות לתוך בארות של צלחת 96 בארות המכילה 300 μL / באר של תמיסת התחדשות (3.5 M KCl, ראה שלב 2.1.6) לילה ב 4 ° C או 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   4. בצע 3 שטיפות של האלקטרודות על ידי טבילת הקצוות לתוך בארות של צלחת 96 בארות המכילה 300 μL / באר של מלח חיץ פוספט (ראה שלב 2.1.1). בצעו כל כביסה במשך 2 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
3. בדיקת קשירה שבוצעה על החיישן
   1. ציפוי HEWL על משטח PANI (פוליאנילין) של האלקטרודה על ידי הפקדת טיפה של 15 μL של 40 מיקרוגרם / מ"ל HEWL שהוכנה ב- PBS על משטח האלקטרודה. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (7°F) או שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   2. בצע שלוש שטיפות של האלקטרודות עם מלח חיץ פוספט (ראה שלב 2.1.1) על ידי טבילת חלקי האלקטרודות של שבבי החיישן לתוך בארות של צלחת 96 בארות המכילה 300 μL / באר של מלח חיץ פוספט. בצעו כל כביסה במשך 2 דקות בערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
   3. הרוו את האלקטרודות על ידי הוספת טיפה של 50 μL של תמיסת החסימה (ראה שלב 2.1.2) על משטח האלקטרודה. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לכבס שלוש פעמים כמתואר בשלב הקודם (ראה שלב 2.3.2).
   4. דלל את תמיסת BlaP-cAb-Lys3 ל- 20 מיקרוגרם/מ"ל בתמיסת קישור (ראה שלב 2.1.3) והחל טיפה של 15 מיקרוליטר של תמיסה מדוללת זו על האלקטרודות. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תגובת האנטיגן-נון, יש לשטוף שלוש פעמים כמתואר בשלב הקודם באמצעות תמיסת השטיפה (ראה שלב 2.1.4). לאחר מכן שטפו את האלקטרודה פעם אחת עם PBS (ראה שלב 2.1.1).
   5. לצורך זיהוי, חבר את שבב החיישן דרך חלק מעגלי הנחושת למולטימטר דיגיטלי. לאחר מכן, התחל את תגובת החיישן על ידי החלת טיפה של 50 μL של תמיסת זיהוי (ראה שלב 2.1.7) על האלקטרודות החיוביות והחלת טיפה של 50 μL של תמיסת NaCl 5 mM על האלקטרודות השליליות (ראה שלב 2.1.7). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. עקוב אחר המוליכות באמצעות multimeter דיגיטלי.
      הערה: המולטימטר סופק על ידי ד"ר פ. בוגארטס, ד"ר ס. יונוס ופרופ' י. גלופצ'ינסקי (האוניברסיטה הקתולית של לוביין-לה-נב - CHU Mont-Godinne. פוטנציוסטט זה נשלט על ידי מחשב באמצעות יציאת USB ומנתח את שמונת השבבים השונים של החיישן בו זמנית. התוכנה שנוצרה על ידי יונוס ועמיתיו יוצרת עלילה בזמן אמת המייצגת את המדידות של הפרש המוליכות בין אלקטרודות הייחוס והדגימה כנגד הזמן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
KH2PO4	סיגמא-אולדריץ'	V000225
K2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	1551128
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S7653
טריס–HCl	רוש	10812846001
EDTA	סיגמא-אולדריץ'	E9884
KCl	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9541
נא2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	NIST2186II
2-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	M6250
אלנין	סיגמא-אולדריץ'	A7627
HClO4	פלוקה	34288	פתרון HClO4 1M, מפיץ : Sigma-Aldrich
קזאין הידרוליזט	סיגמא-אולדריץ'	22090
בנזילפניצילין נתרן	סיגמא-אולדריץ'	B0900000
ליזואנזים לבן ביצה תרנגולת	רוש	10837059001
הפטאן	סיגמא-אולדריץ'	246654
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	322415
תמיסת אמוניום הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	380539	28% NH3 ב-H2O, מטוהרים בזיקוק כפול (מרוכז?)
חומרים מתכלים למעבדה
צלחת 6 בארות	גריינר ביו-וואן	657165	CELLSTAR צלחת 6 בארות
ציוד
מד pH	WTW	1AA110	מד pH מעבדה inoLab pH 7110
מערכת ואקום וסינון	נלג'ין	NALG300-4100	מחזיקי מסנן עם מקלט, מפיץ : VWR
שבבי חיישן פוטנציומטרי			מיוצר על ידי יונוס ועמיתיו (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		הופסקה, מחליפה Autolab PGSTAT302N
מולטימטר דיגיטלי, METRAHit 22M	גוסן מטרוואט		הופסק, יורש בסיס מטרחית