בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

תקציר

מקור: Jaraíz-Rodríguez, M. et al., פפטידים חודרי תאים ביוטינילציה לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון תוך תאי. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

פרוטוקול

1. תאים

1. יומיים לפני תחילת ההליך, צלחו את התאים בצפיפות הנדרשת כדי להיות צמודים ביום הניסוי. לוחית את התאים בצלוחיות או בצלחות. עם זאת, מיצוי חלבון יהיה קל יותר מן הצלחות. זה נוח להכין לפחות 4 צלחות של 78 ס"מ² או 2 צלוחיות של 150 ס"מ² לכל תנאי לכל ניסוי, כדי להיות בטוח כי התוצאות עקביות.
2. במחקר זה, צלחת G166 GSCs אנושיים ב 4 צלוחיות של 150 ס"מ², בתרבית במדיום תאי גזע RHB-A בתוספת 2% B27, 1% N2, 20 ng / mL EGF, ו b-FGF כפי שתואר על ידי פולארד ואחרים. תהליך כאשר הושגה נקודת מפגש. לדוגמה, כאשר 5 x 10⁶ G166 תאים היו מצופים ב 150 ס"מ² צלוחיות, הם עובדו 2 ימים לאחר ציפוי.

2. CPPs ביוטינילציה

1. סובבו את הבקבוקונים המכילים CPPs (BCPPs) ביוטינילציה ליופילית בטמפרטורה של 8200 x גרם למשך 30 שניות, כדי למנוע מחלק מהאבקה להישאר על המכסה. כלול BCPP פקד כדי לוודא שהאינטראקציות שנמצאו ספציפיות לרצף היעד. במחקר זה, BCPP הבקרה היה TATbiotin (TAT-B), והטיפול BCPP היה TAT-Cx43_266-283-B. ניתן להשתמש בפקדים אחרים, כגון TAT המאוחה למקטעים מקושקשים או מוטנטים הקשורים לביוטין.
2. להמיס את BCPPs בתווך התרבית המתאים לתמיסת המלאי שצוינה על ידי היצרן; לדוגמה, כדי לקבל תמיסת מלאי של 2 מ"ג / מ"ל BCPP לטיפול ב- GSCs להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום תרבית GSC לבקבוקון אחד המכיל 1 מ"ג של BCPP. מערבלים ומוודאים שהפפטיד מומס היטב.

3. צינורות

הערה: הכינו לפחות שתים עשרה צינורות של 1.5 מ"ל לכל תנאי הנדרש בסעיף

1. סמן את 3 הצינורות הראשונים לכל מצב. יהיה להם את הנפח הכולל של lysates הסלולר המתקבל בשלב 6.4.
2. סמן A ב-3 צינורות לכל מצב. בצינורות אלה יתקבלו הסופרנאטנטים הראשונים לאחר שכיבה וסיבוב הליזאטים התאיים, שלב 7.2.
3. סמן A B ב-3 צינורות לכל מצב. לצינורות אלה יהיה אליקוט קטן של הסופרנאטנטים הראשונים. ליזטים אלה ישמשו כדגימות הכתם המערבי בשלב 7.3.
4. סמן C ב-3 צינורות לכל מצב. צינורות אלה יקבלו את supernatants לאחר משיכה למטה עם NeutrAvidin, שלב 7.7.
   הערה: זה חשוב במקרה שהכתם המערבי לא הראה אות לחלבונים, כלומר החלבונים לא נמשכו למטה או אבדו בשלב כלשהו של ההליך. אם זה היה המצב, חזור על התהליך כדי למשוך את החלבונים למטה.

4. טיפול תאי עם BCPPs

1. שאפו למדיום התרבותי.
2. החלף את הנפח המתאים של המדיום הטרי הדרוש לדגירת BCPPs בנפח הקטן ביותר האפשרי של התווך בהתאם לזמני הדגירה. חשוב מאוד שבכל מקרה, התווך יכסה לחלוטין את כל פני השטח של הצלחת/בקבוק כדי שהתאים לא יתייבשו, למשל 6 מ"ל ל-150 ס"מ² לדגירת 30 דקות.
3. הוסף את נפח תמיסת המלאי של BCPP לתרביות התאים כדי להגיע לריכוז שהוכח כיעיל. במחקר זה, 50 מיקרומטר TAT-Cx43266-283-B הוכח כמפחית את התפשטות GSC.
   1. לכן, הוסף 92.8 μL של 2 מ"ג / מ"ל TAT-Cx43_266-283-B (MW = 3723.34 גרם / מול) לכל מ"ל של מדיום תרבית כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרומטר TAT-Cx43_266-283-B. אם עוצמת הקול שיש להוסיף שונה עבור פפטידי בקרה, יש להשלים עם מדיום תרבית עד לאותו נפח סופי. לדוגמה, 49.1 μL TAT-B (MW = 1914.31 G/MOL) בתוספת 43.7 ΜL GSC medium נוספו לכל מ"ל של מדיום תרבית כדי לקבל ריכוז סופי של 50 μM TAT-B.
4. מקמו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 30 דקות כדי לוודא שהאינטראקציות בין BCPP לבין שותפיו התוך-תאיים מתרחשות. אם האינטראקציה נמשכת זמן רב יותר, דגרו לזמנים ארוכים יותר או התאימו זמנים במקרה שהניסוי כלל מסלול זמן. בנוסף, ניתן לקדם או למנוע את האינטראקציה של העניין על ידי גירוי מסלולי איתות תוך תאיים שונים.

5. מאגרים ופתרונות

1. הכן PBS pH 7.4: 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na₂HPO₄·2H₂O; 1.7 mM KH₂PO₄.
2. הכן מאגר ליזה חלבון: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, לפני השימוש, להוסיף את הדברים הבאים: 1/100 (v/v) קוקטייל מעכב פרוטאז, 1 mM נתרן פלואוריד, 1 mM פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF) ו 0.1 mM נתרן orthovanadate.
3. הכינו מאגר Laemmli: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7% SDS (p/v); 0.6 M β-mercaptoethanol או 9 mM DTT; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB)).

6. מיצוי חלבונים

הערה: מיצוי חלבון בוצע כמתואר לעיל. בצע את כל החלק הזה של ההליך ב 4 ° C.

1. לשאוף את המדיום התרבותי לחלוטין.
2. יש לשטוף 3 x 10 מ"ל במי מלח חוצצי פוספט קר כקרח (PBS) לכל 150 ס"מ² בזהירות רבה כדי למנוע ניתוק תאים.
3. כדי להשיג את הליזט התא, הוסף 3 מ"ל של חיץ ליזיס לכל 150 ס"מ² ולגרד היטב את פני השטח באמצעות מגרד התא. הטיית הצלחת/בקבוק לכ-45 מעלות תקל על איסוף הליזטים התאיים לצינורות המתאימים להם.
4. יוצקים 1 מ"ל של ליזט סלולרי לכל צינור לתוך שלושה צינורות 1.5 מ"ל. צינורות אלה יסומנו במצב ובשכפול כפי שמצוין בשלב 3.1.

7. נפתח

1. צנטריפוגה צינורות 1.5 מ"ל ב 11,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
2. העבירו את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים (A).
3. קח aliquot של supernatant זה לכל מצב לצינורות שונים (B), כלומר 50 μL לכל צינור. הוסף חיץ 4x Laemmli (16.6 μL עבור 50 μL של ליזט) והקפיא ב -20 ° C. ליזטים אלה ישמשו כרגיל דגימות כתמים מערביים.
4. הומוגניזציה טובה מאוד את NeutrAvidin Agarose על ידי רעד עדין. חותכים את קצות קצות פיפטה כדי להגדיל את הקוטר שלהם ולשפר את pipetting של חרוזים. הוסף 50 μL של NeutrAvidin Agarose לכל מ"ל של ליזט התא בצינורות (A).
5. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה עם רעידות עדינות מאוד כדי לאפשר ל-NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs הקשורים לשותפים התוך-תאיים שלהם.
6. צנטריפוגה ב 3,000 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C כדי לאסוף את הקומפלקס של NeutrAvidin עם חלבונים.
7. הוציאו בזהירות את הסופרנאטנטים והעבירו אותם לצינורות נקיים (C). שמור אותם כדי להשתמש בהם למקרה שהמשיכה כלפי מטה לא תצליח.
8. שלבי שטיפה: הוסף חיץ ליזיס טרי לכדוריות (צינורות A), השהה מחדש על ידי היפוך, וחזור על שלבים 7.6 ו- 7.7 חמש פעמים נוספות. את כל הסופרנאטנטים האלה אפשר להשליך.
9. הסר את supernatants ולהוסיף חיץ 2x Laemmli לנפח הסופי הרצוי (40 μL לכל צינור 1.5 מ"ל עבור כדוריות המתקבלות ס"מ² צלוחיות של תאים מתמזגים).
10. יש לעטוף ב-100°C למשך 5 דקות כדי לנתק את האינטראקציות בין חלבונים וצנטריפוגות למשך 30 שניות ב-8,200 x גרם כדי לגלול חרוזי NeutrAvidin.
11. קח את supernatants, המכילים את החלבונים מנותקים, עם קצוות נימים לצינורות חדשים (D). ניתן לשמור את החרוזים למקרה שנדרשת חזרה על צעדי האלוציה.
    הערה: הסופרנאטנטים (צינורות D) מוכנים כעת להעמסה בכתם מערבי או להקפאה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו G166 GSC	BioRep
מדיום תאי גזע RHB-A	טאקרה	Y40001
חלבון עכבר למינין	Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific	23017-015	10 מיקרוגרם/מ"ל
תוסף B-27 ללא סרום (50X)	Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific	17504-044	2%
תוסף N-2 (100x)	Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific	17502-048	1%
EGF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	AF-100-15	20 נ"ג/מ"ל
b-FGF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	AF-100-18B	20 נ"ג/מ"ל
PBS pH 7.4: במים נטולי יונים, 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4
תאת	GenScript		בהתאמה אישית
TAT-B	GenScript		בהתאמה אישית
TAT-CX43266-283	GenScript		בהתאמה אישית
TAT-CX43266-283-B	GenScript		בהתאמה אישית
פירס™ נויטרווידין™ אגרוז	תרמופישר סיינטיפיק	29200
מאגר ליזה חלבוני: 5 mM Tris HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
נתרן פלואוריד	PanReac AppliChem	141675	1 מ"מ
פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)	סיגמא-אולדריץ'	P7626	1 מ"מ
נתרן אורתוונדאט	סיגמא-אולדריץ'	S6508	0.1 מ"מ
מאגר Laemmli: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7% (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol או 9 mM DTT; 0.04% (v/v) ברומופנול כחול (BB) .