בדיקת שמרים דו-היברידית לקביעת הקשר העצמי של חלבונים בתאי שמרים

תקציר

מקור: Stanczyk, P. J., et al., Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הבדיקה הדו-היברידית של שמרים כדי לזהות אינטראקציות עצמיות ספציפיות של חלבונים. בבדיקה זו, החלבון המעניין מתויג לשני תחומים של גורם שעתוק המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז. כאשר שני החלבונים מתקשרים זה עם זה, הדבר גורם לשעתוק ולתרגום ליצירת האנזים, אשר מזוהה לאחר מכן באמצעות בדיקה ביוכימית.

פרוטוקול

1. טרנספורמציית שמרים

1. קוצרים שמרים באמצעות צנטריפוגה (בצינורות של 50 מ"ל) ב-1,500 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. משליכים את הסופרנטנט, משעים מחדש כל גלולה ב-5 מ"ל של H₂O סטרילי, ומצרפים יחד.
2. צנטריפוגה מחדש ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהשליך את supernatant. גלולת שמרים להשהות ב 1 מ"ל של טרי, סטרילי 1x LiAc / TE.
   הערה: השתמש בתאי שמרים מוסמכים תוך שעה מההכנה.
3. הכינו דגימות פלסמיד (בצינורות של 1.5 מ"ל) על ידי הוספת 200 ננוגרם של DNA פלסמיד עבור טרנספורמציות בודדות, או 0.5 - 1 מיקרוגרם של כל DNA פלסמיד עבור טרנספורמציות משותפות, ו -100 מיקרוגרם של DNA נשא אשכי הרינג (מבושל במשך 20 דקות ומקורר על קרח ממש לפני השימוש).
   הערה: כלול בקרה חיובית, למשל, שמרים שעברו טרנספורמציה משותפת עם pVA3 (קידוד לאיחוי DNA-BD GAL4 עם חלבון p53) ו-pTD1 (קידוד להיתוך GAL4 AD עם אנטיגן T גדול SV40).
4. הוסף 100 μl של תרחיף שמרים טרי מוכן ומוכשר ו- 600 μl של תמיסת LiAc/PEG 1x (8 מ"ל של מלאי PEG 3350, 1 מ"ל של מלאי TE, 1 מ"ל של LiAc מלאי), ומערבולות במשך ~30 שניות. דגירה ב 30 ° C במשך 30 דקות עם רעד ב 200 סל"ד.
5. מוסיפים 80 μl של dimethyl sulfoxide (ריכוז סופי של 10% v/v) ומערבבים היטב על ידי היפוך עדין. יש לחמם שוק חשמלי במשך 15 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס תוך ערבוב כל 2-3 דקות.
6. יש לצנן את תרחיף התאים על קרח למשך 2 דקות ואת הצנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 15 שניות ב-RT כדי לשחזר שמרים.
7. גלולת תא השהיה מחדש ב 100 μl של 1x TE וצלחת על לוחות בינוניים SD מינימליים מתאימים לצמיחה סלקטיבית (בינוני חסר לאוצין וטריפטופן כדי לשמור על לחץ סלקטיבי הן על הפיתיון והן על פלסמידים המטרה).
8. דגירה על לוחות הפוכים ב 30 ° C עד מושבות הם ~ 2 מ"מ בקוטר (בדרך כלל 4 - 5 ימים). צלחות ניתן לאחסן ב 4 °C במשך 2 - 3 שבועות; לאחסון ארוך יותר, יש לאחסן במלאי גליצרול ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
   הערה: ודא כי פיתיון וחלבוני מטרה באים לידי ביטוי בשמרים על ידי immunoblotting וכי אין להם הפעלה אוטונומית של גן reporter כאשר הם באים לידי ביטוי בנפרד בשמרים.
9. הוסף 100 μl של תרחיף שמרים טרי מוכן ומוכשר ו- 600 μl של תמיסת LiAc/PEG 1x (8 מ"ל של מלאי PEG 3350, 1 מ"ל של מלאי TE, 1 מ"ל של LiAc מלאי), ומערבולות במשך ~30 שניות. דגירה ב 30 ° C במשך 30 דקות עם רעד ב 200 סל"ד.
10. מוסיפים 80 μl של dimethyl sulfoxide (ריכוז סופי של 10% v/v) ומערבבים היטב על ידי היפוך עדין. יש לחמם שוק חשמלי במשך 15 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס תוך ערבוב כל 2-3 דקות.
11. יש לצנן את תרחיף התאים על קרח למשך 2 דקות ואת הצנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 15 שניות ב-RT כדי לשחזר שמרים.
12. גלולת תא השהיה מחדש ב 100 μl של 1x TE וצלחת על לוחות בינוניים SD מינימליים מתאימים לצמיחה סלקטיבית (בינוני חסר לאוצין וטריפטופן כדי לשמור על לחץ סלקטיבי הן על הפיתיון והן על פלסמידים המטרה).
13. דגירה על לוחות הפוכים ב 30 ° C עד מושבות הם ~ 2 מ"מ בקוטר (בדרך כלל 4 - 5 ימים). צלחות ניתן לאחסן ב 4 °C במשך 2 - 3 שבועות; לאחסון ארוך יותר, יש לאחסן במלאי גליצרול ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: ודא כי פיתיון וחלבוני מטרה באים לידי ביטוי בשמרים על ידי immunoblotting וכי אין להם הפעלה אוטונומית של גן reporter כאשר הם באים לידי ביטוי בנפרד בשמרים.

2. מושבה-להרים נייר סינון β-גל Assay

1. הכן את המאגרים הבאים:
   1. הכנת מאגר Z המכיל 100 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl ו-1 mM MgSO₄; כוונן את רמת החומציות ל-7.4. לעקר על ידי autoclaving ולאחסן ב RT.
   2. הכינו את חיץ X-Gal על ידי המסת 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside ב-20 מ"ג/מ"ל ב-N,N-dimethylformamide, ואחסנו בחושך בטמפרטורה של -20°C. הכינו את Z buffer/X-Gal solution. יש ליצור חיץ לפני השימוש על ידי ערבוב X-Gal במינון 0.33 מ"ג/מ"ל ו-β-מרקפטואתנול ב-0.27% v/v במאגר Z. יש להשתמש ב-2.5 מ"ל לדגימה.
2. הוסיפו 2.5 מ"ל של תמיסת Z buffer/X-Gal טרייה לצלחת נקייה בקוטר 100 מ"מ והניחו אותה בתוך נייר מסנן תאית.
3. הניחו נייר סינון חדש על פני הצלחת עם מושבות השמרים שיש לבדוק. שפשפו בעדינות את נייר הסינון על הצלחת במלקחיים והשאירו למשך ~5 דקות למושבות לחיבור.
   הערה: לעבד את הבקרה החיובית במקביל, כלומר, שמרים שעברו טרנספורמציה משותפת עם pVA3 ו-pTD1.
4. הרימו את נייר הסינון וטבלו אותו (במלקחיים) לתוך מאגר של חנקן נוזלי למשך 30 שניות (יש לטפל בחנקן נוזלי בזהירות; יש ללבוש תמיד כפפות עבות ומשקפי מגן). תן לנייר המסנן הקפוא להפשיר ב- RT למשך ~ 2 דקות.
5. הניחו את נייר הסינון (צד מושבה כלפי מעלה) על גבי נייר הסינון שהושרה מראש בתוך צלחת 100 מ"מ, ודגרו בטמפרטורה של 30°C.
6. בדוק מעת לעת (כל ~ 30 דקות) את המראה של מושבות כחולות.
   הערה: פיתיון חלש: אינטראקציות מטרה עשויות להימשך מספר שעות כדי לייצר אות כחול חיובי (הימנעו מדגירה ממושכת (>8 שעות) שעלולה לתת תוצאות חיוביות שגויות). לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש מושבות חדשות co-transformed, כלומר, גדל ב 30 ° C במשך 4 - 5 ימים, ~ 2 מ"מ קוטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אינקובטור צלחות	הראוס	B6120	מכשיר
אינקובטור שייקר אורביטלי	ניו ברנזוויק סיינטיפיק	אינובה 4300	מכשיר
ספקטרופוטומטר	פרקין אלמר	Lambda Bio+	מכשיר
ערכת Matchmaker Two-Hybrid System 2	טאקרה קלונטק	K1604-1	מכיל וקטור פיתיון pGBKT7, וקטור טרף pACT2 וזן שמרים Y190
בסיס חנקן שמרים	סיגמא-אולדריץ'	Y0626	להכנת מדיום גידול SD מינימלי
תוסף נשירה חסר לאוצין וטריפטופן	סיגמא-אולדריץ'	Y0750	להכנת מדיום גידול SD מינימלי
תוסף נשירה חסר לאוצין, טריפטופן, היסטידין	סיגמא-אולדריץ'	Y2001	להכנת מדיום גידול SD מינימלי
אשכי הרינג נשאים DNA	טאקרה קלונטק	630440	לשינוי שמרים
נייר סינון Whatman כיתה 5	סיגמא-אולדריץ'	WHA1005070	לשימוש בנייר פילטר הרמת מושבה בדיקת β-גל
X-גל (5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוסיד)	סיגמא-אולדריץ'	B4252	לשימוש בנייר פילטר הרמת מושבה בדיקת β-גל