בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

תקציר

מקור: Ma, Z., et al. טיהור זיקה טנדם של קומפלקסים חלבוניים מתאים אאוקריוטים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טיהור זיקה טנדם – טכניקה לטיהור קומפלקסים חלבוניים מתאים איקריוטים כדי לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון. הקומפלקס מכיל שני חלבונים המסומנים בתגי אפיטופ שונים. עם טיהור המתחם באמצעות שני שרפים בעלי זיקה לשני התגים השונים באופן רציף, נוכחותם של שני החלבונים באלוטה מאשרת את האינטראקציה בין השניים.

פרוטוקול

1. ציפוי תאים

1. יום אחד לפני ההעברה, צלחת 3.5 x 10⁶ HEK293T תאים ב 10 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) בתוספת 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS) ו 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/ml מלאי) לכל צלחת 100 מ"מ. צלחת 3 - 5 100 מ"מ² מנות לכל ניסוי / מצב כדי להבטיח התאוששות חלבון מספקת.
   הערה: יש לקבוע את מספר הצלחות עבור כל ניסוי/תנאי, אשר יסתמכו על רמות הביטוי והמסיסות של קומפלקס החלבונים המעניין. לחלופין, אם יש צורך בטיהור בקנה מידה גדול יותר, ניתן להתאים קווי תאים לגידול בתרחיפים בצלוחיות ספינר, אך שיטה זו לא תעבוד עבור טרנספקציות חולפות.

2. הדבקת תאים או גרימת קווי תאים יציבים

1. למחרת, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ. התאים חייבים להיות 70 - 80% במפגש לפני שתמשיך.
2. להדביק את התאים עם תערובת כוללת של 7 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ו 21 μl של מגיב transfection לכל צלחת 100 מ"מ. תאים טרנספקטים עם וקטור המבטא GFP (טבלה 1) כבקרה ליעילות טרנספקציה.
   הערה: אם משתמשים ב- HEK293-T-REx או בקו תאים יציב דומה המשרה ביטוי של שתי תת-יחידות מורכבות או יותר בתגובה לדוקסיציקלין, יהיה צורך להוסיף את המשרה לתאים ולדגור במשך 48 שעות. באופן דומה, קו תאים יציב המשרה את הביטוי של GFP עם הוספת המשרה, יידרש גם למטרות אימות. המשך לשלב 2.7.
3. מכינים את תערובת transfection לכל צלחת 100 מ"מ. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מערבבים 500 μl של DMEM ללא תוספת עם 7 מיקרוגרם של DNA פלסמיד כולל (המקביל לשני פלסמידים או יותר). בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד, מערבבים 500 μl של DMEM ללא תוספת עם 21 μl של מגיב transfection. חזור על הפעולה עבור כל תגובת טרנספקציה.
4. פיפטה את תמיסת מגיב הטרנספקציה לתמיסת ה- DNA של פלסמיד (אין לערבב תמיסות בסדר הפוך). מערבבים על ידי pipetting לפחות 4 פעמים.
5. יש לדגור על תערובת זו בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות, אך לא יותר מ-15 דקות.
6. הטו את הצלחת ליצירת מאגר מדיה והעבירו בזהירות את תערובת הטרנספקציה לצד הפנימי של הצלחת מבלי להפריע לתאים. מחזירים את המנה למקומה השטוח המקורי ומערבלים בעדינות לפיזור התערובת.
7. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים לח עם 5%_CO2 (מצב זה מכונה להלן "אינקובטור תרביות רקמות"). החלף את המדיה 5 שעות לאחר הטרנספקציה (אופציונלי).

3. בדיקת יעילות טרנספקציה או אינדוקציה

1. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את יעילות הטרנספקציה (או אינדוקציה של קו תאים יציבים HEK293T-REx המבטא GFP). דוגרים עוד 24 שעות.

4. טיהור זיקה STREP (STREP AP)

1. איסוף התאים
   1. לאחר 48 שעות לאחר ההעברה, הסר את המדיה והוסף 8 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS). פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק תאים מהצלחת.
   2. אספו והעבירו את תרחיף התא לתוך צינור של 15 מ"ל וסובבו את התאים כלפי מטה ב 800 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C.
   3. הסר את הסופרנאטנט של PBS. חזור על הסחרור כלפי מטה (800 x גרם במשך דקה אחת ב- 4 ° C) כדי לסלק PBS שיורית. אחסנו את כדורית התא בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי או בצעו את ההליך שלהלן כדי להמשיך בטיהור החלבון.
2. שכיבת התאים
   1. השהה מחדש את כדורי התא באמצעות 5× נפח כדורי התא (~ 250 מיקרוליטר לצלחת) של חיץ ליזה פסיבי (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, טבלית קוקטייל מעכב פרוטאזות, 5% v/v גליצרול ו- 1.0% NP-40) והעבר את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   2. מערבלים בקצרה את המתלה ואת nutate במשך 30 דקות ב 4 °C.
   3. סובב את מתלה התא במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
   4. מעבירים את הליזטים המסיסים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל ומשליכים את כדורי התא. שמור 10% מהנפח הסופי של הליזט המסיס כ"קלט STREP AP". יש לאחסן ב-4°C.
3. איזון חרוזי STREP
   הערה: השתמש בחרוזי STREP לשלב AP הראשון! קומפלקסים שנמשכו למטה עם חרוזי STREP מחזירים הרבה יותר חלבון מאלה שנמשכו למטה עם חרוזי FLAG.
   1. הוציאו (n × 40 μl) + n μl של תרחיף חרוזי STREP 50% (n = מספר הדגימות) וסחררו מטה ב- 1,500 x g למשך 2 דקות ב- 4 °C.
      הערה: השתמשו בקצוות רחבים לחרוזי פיפטה.
   2. הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של PLB לחרוזים. אגוז את תערובת החרוזים במשך 5 דקות ב-4°C. סחור כלפי מטה ב-1,500 x גרם במשך 2 דקות ב-4°C.
      1. חזרו על הפעולה במשך 3 כביסות בסך הכל. השהה מחדש את החרוזים ב- PLB לנפח סופי של n × 40 μl.
   3. הוסף 40 μl של 50% STREP חרוזי slurry לכל דגימת ליזט התא ו nutate במשך 2 שעות ב 4 ° C.
4. STREP AP
   1. סובב את התמיסה במהירות של 1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C.
   2. הסר את הסופרנאטנט ואחסן אותו כ- "STREP AP Flow-Through (FT)" ב- 4 ° C.
   3. הוסף 500 μl של STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5% glycerol ו-0.2% NP-40) לחרוזים. אגוז את תערובת החרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C וצנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
      1. חזור על הפעולה במשך 4 כביסות בסך הכל.
         הערה: לפני השטיפה הרביעית, העבירו את תמיסת החרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל כדי להפחית את רקע החלבון. שלב זה הוא חיוני.
   4. הוסף 500 μl Wash Buffer II (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl ו- 1 mM EDTA) ואזן את החרוזים על ידי היפוך הצינורות. סובב כלפי מטה ב- 1,500 x גרם למשך 2 דקות ב- 4 ° C והשלך את הסופרנטנט.
   5. יש להקפיד על החלבון המעניין עם 50 μl של STREP Elution Buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ו-2.5 mM Desthiobiotin). מערבולת ב-800 סל"ד למשך 15 דקות ב-4°C.
   6. סובבו את החרוזים כלפי מטה במהירות של 1,500 x גרם למשך דקה אחת ב-4°C. אספו את הסופר-נטנט. חלק זה מתאים למדגם "STREP AP Elution".
   7. שמור את חלק החרוזים ב 4 ° C עבור elution השני, אשר יכול להניב עד מחצית מכמות החלבון המתקבל עם ההדבקה הראשונה. Aliquot 10% של STREP AP Elution עבור צביעת כסף ו / או כתמים מערביים.
5. איזון חרוזי FLAG
   1. הוציאו (n x 16 μl) + n μl של תמיסת חרוזי FLAG (n = מספר הדגימות) וסובבו כלפי מטה ב- 1,500 x g למשך 2 דקות ב- 4 °C.
      הערה: השתמשו בקצוות רחבי פה לחרוזי פיפטה.
   2. הסר את הסופרנאטנט והוסף 500 μL של חיץ כביסה FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ו- 0.1% NP-40) לחרוזים. יש לסחוט כלפי מטה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C. לחזור על הפעולה במשך 3 שטיפות בסך הכל.
   3. השהה מחדש את החרוזים במאגר הכביסה FLAG לנפח סופי של n x 16 μl.
   4. יש להוסיף 16 μl של תרחיף חרוזי FLAG לשארית STREP AP elution ואגוז למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.

5. דגל IP

1. סובב כלפי מטה את מתלה חרוזי FLAG ב- 1,500 x גרם למשך 2 דקות ב- 4 ° C. שמור את הסופרנאטנט ואחסן אותו כ- "FLAG IP Flow-through" (FT) ב- 4 ° C.
2. הוסף 500 μl של חיץ כביסה FLAG לתמיסה. אגוז למשך 5 דקות ב-4°C וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C. חזרו על הפעולה במשך 4 שטיפות בסך הכל והוציאו את הסופרנאטנט לאחר כל שטיפה.
   הערה: לפני השטיפה הרביעית, העבירו את תמיסת חרוזי החלבון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל כדי להקטין את הרקע. שלב זה הוא חיוני.
3. הסר את הסופרנאטנט מהסחרור הסופי והוסף 30 μL של חיץ שטיפה FLAG המכיל 200 ng/μl של פפטיד FLAG לחרוזים. מערבולת ב-800 סל"ד למשך שעתיים ב-4°C.
4. סובב את המתלים כלפי מטה ב- 1,500 x גרם למשך 2 דקות ב- 4 ° C. קצור את הסופרנאטנט ואחסן ב- 4 ° C כ- "FLAG IP ELUTION."
   הערה: ניתן לאשר את דגימות האלוציה על ידי כתם כסף ו/או כתם מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, והן מוכנות לבדיקות חלבון נוספות. בעת הגדרת כתם מערבי, הפעל את כל הדוגמאות הבאות: (1) כניסת נקודת גישה מסוג STREP, (2) כניסת STREP AP FT, (3) כניסת AP מסוג STREP, (4) סימון IP FT ו- (5) סימון IP Elution. יהיה צורך לקבוע נפחים נטענים עבור כל ניסוי. ניתן לאחסן את כל הדגימות והחרוזים שנאספו ב -4 ° C לאחסון לטווח קצר וב -80 ° C לאחסון לטווח ארוך. דגימות TAP יכולות להיות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסות כדי לאמת את זהות מרכיביהן, לזהות שינויים חדשים לאחר תרגום (PTM), ו / או לגלות כל אינטראקציה חלבונית חדשה עם הקומפלקס המטוהר. לשם כך, לאחר הפעלת ג'ל קומאסי או כתם כסף, ניתן להוציא רצועות מהג'ל באמצעות אזמל נקי. מספר ביקורות מצוינות הדנות בשיטות ספקטרומטריית מסות פורסמו בעבר.

תוצאות

טבלה 1: פלסמידים ששימשו במחקר זה. CycT1 ו-CDK9 נקשרו לווקטורי הפלסמיד pcDNA/4TO-STREP ו-pcDNA/4TO-FLAG. מבנים אלה הפכו לתאים מוכשרים DH5α וצופו על לוחות LB-Ampicillin. מושבות נבחרו, גדלו ונבדקו. שיבוטים שקושרו בהצלחה אומתו על ידי ריצוף סנגר והשילוב של עיכול הגבלה ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עבור CycT1 השתמשנו בגרסה קצרה יותר (1 - 708) במקום באורך מלא (1 - 726) מכיוון ש- 18 השאריות האחרונות מכילות רצף PEST (רצף פפטידי עשיר בפרולין, חומצה גלוטמית, סרין ותראונין), הפועל כפפטיד אות לפירוק חלבונים. CDK9 היה באורך...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM)	פישר סיינטיפיק	SH30022FS
סרום בקר עוברי	היקלון	SH30071
פניצילין/סטרפטומיצין	פישר סיינטיפיק	MP091670049
פוליג'ט	פישר סיינטיפיק	50-478-8
קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	11836153001
STREP-Tactin Superflow	איבא	2-1208-010
מאגר ELUTION STREP-TAG	איבא	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	סיגמא	SLBQ1981V
קורנינג 100 מ"מ × 20 מ"מ בסגנון תרבית תאי צלחת מטופלים פוליסטירן לא פירוגני 20/שרוול	קורנינג	430167
חלבון Lo-Bind Eppendorf	פישר סיינטיפיק	13-698-794
מערבל מערבולות דיגיטלי	פישר סיינטיפיק	02-215-370
מתלה קצף מיקרו צינור 48 חורים	פישר סיינטיפיק	02-215-386
רוטיסרי שייקר Labquake	תרמו	415110