$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
במחקר הנוכחי, חלבון היתוך דמוי אוביקוויטין (SUMO) CVN-small ubiquitin-like modifier שימש במבחני אימונוסורבנט מקושרי אנזימים במקום CV-N והוא מתאים לבדיקות מבוססות תאים. חלבון רקומביננטי מסוג HA H3 מתקבל באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) או מבוטא בקווי תאים HEK293 של יונקים ובתאי חרקים נגועים בבקולו-וירוס בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. חלבון ספייק ווהאן-1 מתבטא בתאי HEK293 של יונקים. הסינתזה של פפטיד מונו-מנוסילציה (MM) ופפטיד די-מנוסילציה (DM) מאפשרת זיהוי ליגנדים הומוגניים ל-CVN2 ומולקולות קטנות מונו-מנוסילטיות.
1. יצירת מבני CV-N
- עבור כל אחד מהווריאנטים CVN2 וחלבון CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), קבל את מבנה הגן עם רצף מוביל pelB N-terminal ותג His-tag בווקטור pET27b(+) ממקורות מסחריים (ראה טבלה 1).
- השג CVN2L0 וגרסאותיו (V2, V3, V4 ו- V5; איור 1A,C) ברקע של גן תבנית CVN2L0 המורכב משני רצפי דנ"א נפרדים עבור כל CV-N חוזר.
- ממיסים את DNA הפלסמיד הליופילי במים מזוקקים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (ddH2O) לריכוז סופי של 100 ננוגרם/μL.
2. הכנת לוחות LB-agar עם תאים טרנספורמציה של DNA פלסמיד
- הכינו תרבית בינונית LB-Lennox על ידי המסת 10 גרם / ליטר של פפטון, 5 גרם / ליטר של תמצית שמרים, ו 5 גרם / ליטר של NaCl ב ddH2O (ראה טבלה של חומרים), ולהתאים את ה- pH ל 7.4. בצע את הטרנספורמציה ל- E. coli BL21 (DE3) מוכשר עבור כל גרסה (V2-V5) בשיטה כימית בעקבות דוח שפורסם בעבר.
- לפצל את התמיסה (900 μL ו 100 μL), להעביר 100 μL על לוחות LB-אגר (50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin), ולהשתמש בעדינות מפזר תאים סטרילי. לדגור את צלחות אגר לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
3. שיבוט
- לשכפל את הגן עבור CV-N לאתרי NdeI ו-BamHI של pET11a (ראו טבלת חומרים) לצורך טרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-כשירים לאחר התייחסות.
4. מוטגנזה מכוונת אתר
- כדי ליצור CVN2L0 ו- CVN-E41A מוטנטי ברקע של גן תבנית CVN2L0 המכיל שני רצפי DNA מובחנים עבור כל CV-N חוזר.
- צור מוטציות באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת אתר (ראה טבלת חומרים) ופריימרים מוטגניים ספציפיים 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ו- 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' להפעלת PCR.
- התחל סדרה של תגובות דגימה באמצעות ריכוזים מרובים של תבנית DNA דו-גדילי (dsDNA) בטווח של 5-50 ng (לדוגמה, 5, 10, 20 ו- 50 ng של תבנית dsDNA). שמור על ריכוז פריימר קבוע.
הערה: תערובת PCR ופרוטוקול מחזור תרמי משמשים בדרך כלל כמתואר במדריך ההוראות עבור ערכת מוטגנזה מכוונת אתר.
- הוסף את אנזים הגבלת DpnI (1 μL, 10 U/μL, ראה טבלת חומרים) מתחת לשכבת העל של שמן מינרלי. ערבבו היטב ובעדינות את התגובות, סובבו מטה במיקרו-צנטריפוגה שולחנית למשך דקה אחת, ודגרו מיד בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת לעיכול ה-dsDNA העל-מפותל של ההורים.
5. טרנספורמציה של תאי חיידקים
- הפשירו בעדינות את התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue (ראו טבלת חומרים) על קרח. כדי להפוך כל תגובת בקרה ודגימה, aliquot את התאים סופר מוכשרים (50 μL) לצינור פוליפרופילן עגול תחתית מראש (14 מ"ל).
- העברה של 1 μL של DNA חד-גדילי מטופל Dpn I (ssDNA) מכל תגובת בקרה ודגימה (ssDNA מוטציה) לאליציטוטים נפרדים של התאים הסופר-מוכשרים, המסנתזים את הגדיל המשלים. מערבלים את תגובות הטרנספורמציה בזהירות כדי לערבב ולדגור את התגובות על קרח במשך 30 דקות.
הערה: לפני העברת ה- DNA שטופל ב- Dpn I לתגובת הטרנספורמציה, מומלץ להסיר בזהירות את שאריות השמן המינרלי מקצה הפיפטה. כבקרה אופציונלית, יש לבדוק את יעילות הטרנספורמציה של התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue על ידי ערבוב 0.1 ng/μL של פלסמיד הבקרה pUC18 (1 μL) עם אליציטוט 50 μL של התאים הסופר-מוכשרים.
- החל דופק חום על תגובות השינוי ב 42 ° C במשך 45 שניות, ולאחר מכן מניחים את התגובות על קרח במשך 2 דקות.
הערה: דופק החום המוחל כבר הותאם לתנאים שהוזכרו בצינורות פוליפרופילן עגולים (14 מ"ל).
- הוסף 0.5 מ"ל של מרק NZY+ (המכיל לליטר: 10 גרם אמין NZ (קזאין הידרוליזט), 5 גרם תמצית שמרים, 5 גרם NaCl, 12.5 מ"ל של 1 M MgCl2, 12.5 מ"ל של 1 M MgSO4, 10 מ"ל של 2 M גלוקוז, pH 7.5, ומחומם מראש ל 42 ° C) ודגר על תגובות השינוי ב 37 ° C עם רעד ב 225-250 סל"ד במשך 1 שעות. צלחת את הנפח הנכון של כל תגובת טרנספורמציה (5 μL מטרנספורמציית פלסמיד בקרה; 250 μL מטרנספורמציית דגימה) על לוחות אגר LB-ampiclin.
הערה: עבור בקרות הטרנספורמציה והמוטגנזה, יש לפזר תאים על לוחות אגר LB-ampicillin בעלי 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, 80 μg / mL) ו isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG, 20 mM) (ראה טבלה של חומרים). חסן 50 מ"ל של תרביות תאים עם מושבה אחת של תאי E. coli מותמרים כדי לטהר DNA פלסמיד מוטציה לניתוחים. מוטגנזה מאושרת על ידי ריצוף DNA במתקן חיצוני.
6. ביטוי וטיהור חלבונים
- עבור תרבית בקנה מידה גדול, לחסן כמות קטנה של LB (המכיל אמפיצילין) עם מושבה אחת מן הצלחת מותמרת.
- באמצעות תרבית לילה, לחסן את תרבית הביטוי עם תוספים, כגון 10 mM של MgCl2, 10 mM של MgSO4, ו 20 mM של גלוקוז, מדלל את תרבית הזרעים ל 1/100.
- לגדל תאים עם רעידות נמרצות ב 37 ° C. לגדל תאים ל Abs 600 ננומטר בין 0.4-0.6 (שלב אמצע לוג) לפני קירור התאים ל 20 ° C. השרייה עם 1 mM IPTG ולגדול לילה.
- לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את supernatant עם פיפטה.
- השהה מחדש את כדורית התא במאגר מלח חוצץ פוספט (PBS) וצנטריפוגה מחדש ב 4,000 x גרם למשך 15 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה. יש להשהות מחדש את הגלולה הנותרת ב-10 מ"ל של חיץ ליזיס ולדגור על המתלה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C.
הערה: הרכב חיץ ליזיס: (50 mM של NaH2PO4, 300 mM של NaCl, 2% Triton-X 100, 500 ng/mL של lysozyme, 1 mM של phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM של dithiothreitol, 1 mM של MgCl2, pH 8, ראה טבלה של חומרים).
- העבירו את התערובת לשני מחזורי הקפאה-הפשרה (-80°C). הפרידו שברים מסיסים ובלתי מסיסים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C ונתחו אותם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE), בפרט, נתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE (איור 1B, C).
הערה: תאים יכולים להיות lysed במספר דרכים, כגון הקפאה-הפשרה, סוניקציה, הומוגניזציה, ליזה אנזימטית, או שילוב של שיטות אלה. טיהור מגופי הכלה מומלץ לאיסוף תשואות חלבון גבוהות.
- טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיית עמודת Ni-NTA (ראה טבלת חומרים). טען את המקטע המסיס על עמודת חרוזי Ni-NTA מחודשת (1 מ"ל/דקה). שטפו את המערכת עם מאגר TBS (50 מילימטר של טריס, 150 מילימול נתרן כלורי, pH 7.5) לפני התחלת שיפוע (0-100% 500 מילימטר אימידזול ב-TBS במשך 60 דקות) ואיסוף שברים (1 מ"ל/דקה). דיאליזה של החלבונים המטוהרים לצורך אפיון ביוכימי כנגד PBS של 100 מילימטר (איור 1C, D).
- לחלופין, השתמש בג'ל זיקה His-Select Ni2+ (ראה טבלת חומרים) בצינורות של 14 מ"ל כדי לקשור ולהשהות מחדש את CV-N המתויג שלו באופן רקומביננטי בתמיסות חיץ עם 20 mM imidazole ו- 250 mM imidazole, בהתאמה. יש לדגור באצווה למשך 30 דקות לפחות < בר/>
הערה: החל חלבונים מטוהרים למחצה אלה על עמודה ארוזה מראש לשימוש חד פעמי להחלפת חיץ וניקוי של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, פחמימות וחלבונים, אשר יכולים לטעון 1-1.5 מ"ל פולט מכרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת.
- העבירו את תמיסות החלבון לצינורות צנטריפוגות עם מסנן חיתוך של 10 kDa (ראו טבלת חומרים) ורכזו אותן בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4,500 x גרם ו-4°C. למדידות SPR, החליפו את תמיסות האנליטים ב-10 mM HEPES, 150 mM נתרן כלורי, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ו-0.05% Tween20, pH 7.4 (HBS-EP(+), ראו טבלת חומרים).
- הוסף מאגר הפעלה SPR זה למקדם דילול של 1:10 וצנטריפוגה ארבע פעמים לנפח ההתחלתי למשך 10 דקות ב- 4,500 x g ו- 4 ° C.
- קבע את ריכוז החלבון ב- 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis NanoDrop (ראה טבלת חומרים) בהתבסס על מקדם ההכחדה המחושב (20,440 M-1 cm-1) עבור החלבון העיקרי CVN2L0 בגודל של 23,474 Da. השתמש ב- PBS (100 mM, pH 7.0) או במאגר SPR כריק, ומדוד את ריכוז החלבון בשלושה שלבי דילול (1:1, 1:10 ו-1:100).
7. ספקטרוסקופיית SPR
- השתמש במערכת SPR בערוץ כפול (ראה טבלת חומרים) עם מאגר פועל HBS-EP(+) ו- 10 mM גליצין HCl pH 1.5-1.6 כמאגר רגנרציה. הפעל את המכשיר, degasser, דוגם אוטומטי, ומשאבה, ולשטוף את המערכת כולה עם ddH20 במשך 1 שעות. הניחו את מאגר הריצה המוכן לשימוש בבקבוק נפרד.
- יש להטיל שמן טבילה על הגלאי ולהרכיב שבב חיישן זכוכית (ראו טבלת חומרים) המצופה בסרט זהב דק ובצידו העליון מתפקד עם קרבוקסימתיל דקסטרן הידרוג'ל ישירות על הגלאי שמתחת לתא הזרימה בעל שלוש היציאות. תקן את ההגדרה על-ידי משיכת הטיפול כלפי מטה.
הערה: C19RBDHC30M 200 ננומטר סטרפטאבידין derivatized carboxymethyl dextran hydrogel עם צפיפות בינונית של biotinylated חמור תסמונת נשימה חריפה חמורה coronavirus-2 RBD חלבון, הוא שבב חיישן מוכן לשימוש עם ליגנד pre-immobilized.
8. בדיקת קשירת SPR עבור קישור CV-N לחלבון HA, S ו- RBD
- יש לשתק את הליגנדות החלבוניות לשבבי חיישנים לפי השלבים הבאים.
- פתח טבלה רצה על-ידי לחיצה על טופס בשורת התפריטים והפעל את עורך הטבלה בתוכנת SPRAutoLink המשולבת (ראה טבלת חומרים). בחר ולחץ על BASIC_Immobilization מרשימת טבלאות ההפעלה הזמינות ופעל לפי השלבים של הליך הניסוי על מסך המחשב. עורך הדוגמאות המתאים שבו נעשה שימוש מוצג בפינה העליונה הימנית.
- לחץ על Sample Set Editor בקטע Form כדי למלא את רשימת הריאגנטים עבור שני ארונות תקשורת הממוקמים ב- autosampler לניתוחים נוספים. לחץ על Autosampler Direct Control כ"כלי" בשורת התפריטים כדי להביא את המדפים קדימה או בחזרה הביתה. בחר 4 °C כטמפרטורת ההפעלה.
הערה: תוכנת SPR מאפשרת "SPR Instrument Direct Control" ו-"Pump Direct Control" באמצעות בחירת הכלים המתאימים, כמו גם טיפול בדוגמית אוטומטית, ועל ידי לחיצה על טופס; כמו כן, ניתן לבחור באפשרות Run Table Editor, Data-plot או Post-Processing לביצוע ניתוח נתונים. קבצים נשמרים ישירות בספריית ברירת המחדל ומיוצאים כ- scrubber.files מהחלון Post-Processed.
- הפעל את המשאבה כדי להחדיר ddH20 על ידי לחיצה על כלים ומשאבה שליטה ישירה ולהקליט נתונים על ידי לחיצה על SPR Instrument Direct Control, ובכל פעם התחל בחלונות החדשים שהופיעו. שים את ריאגנטים צימוד (שלב 8.3) בקבוקונים 300 μL, לשים אותם לתוך מתלים autosampler, ולהתחיל את הטבלה לרוץ על ידי לחיצה על Run.
הערה: משטחי שבב מותנים עם 10 mM גליצין buffer pH 9.0 או עשויים להיות סמוקים עם 1 M נתרן כלורי, 0.1 M נתרן borate buffer pH 9.0 כדי לרכך משטח שבב carboxyl derivatized עבור תערובת ההפעלה EDC/NHS.
- עבור אינטראקציה פשוטה זו של חלבון-חלבון, השתמש בשבב CMD500D (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור יחידת אינדקס מיקרו-שבירה (μRIU) = 2500 - 3000 תא זרימה עם HA משותק ותא זרימה μRIU = 400 עם חלבון ספייק. בקצב זרימה של 15 μL/min, הזריקו תערובת מימית ושווה של 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylamino propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC*HCl) ו-0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) על ידי יישום השלבים הבאים ברצף.
- מילוי מחדש של משאבת מילוי מחדש במהירות של 25,000 מיקרוליטר/דקה, ביצוע כוונון קו בסיס למשך 30 שניות, הזרקת 90 מיקרוליטר של תמיסת הפעלת דגימה (EDC/NHS) במשך זמן מגע של 6 דקות, ולאחר מכן החזק למשך 5 דקות נוספות.
- חזור על מחזור זה לאחר ריצה בסיסית במשך דקה אחת ב- 10 μL/min רק על תא הזרימה השמאלי (כחול) כדי להזריק ולשתק פפטידים, HA וחלבון ספייק מסונתזים כימית ב- 20 מיקרוגרם/מ"ל, ולאפשר את ההתאמה הבסיסית הבאה עם ddH2O למשך 1.5 דקות לפני המרווה את משטח השבב המופעל עם 1 M אתנולמין HCl pH 8.5.
- העבירו את הצינורות מדוגם הנוזל למנטרל מ-ddH20 לתוך הבקבוק באמצעות HBS-EP(+) (איור 2).
- נתח את חיישני SPR.
- כדי לבצע מחקרים קינטיים, השתמש בריכוזי אנליטים שונים (10-5-10-8 M), עם שלב התחדשות לאחר כל זריקה ומדידות ריקות לאחר אנליטות שונות. שנה את קצב הזרימה ל- 10 מיקרוליטר לדקה והתחל הזרקות למשך זמן מגע של 4 דקות, לאחר מכן יצירת קו בסיס של 5 דקות, ושני שלבי התחדשות של 2 דקות כל אחד עם מרווח של 30 שניות.
- הזריקו את תמיסת החיץ למדידות ריקות שהחיישנים שלהן מופחתים מריצות הדגימה כדי לנרמל ריכוזי חלבונים שונים.
- לחץ על טופס, גלול מטה ושנה ל"לאחר עיבוד" על ידי לחיצה על מצב פעולה זה. לחצו על 'הוסף' לבחירת עקומות כריכה שנוצרו לאורך זמן בטופס התוויית הנתונים לכל תא זרימה, וייצאו את הכיסוי כקובץ scrubber ( .ovr). לחץ על קובץ כדי לפתוח את אפשרויות שמירת הקובץ. קבל עקומות תגובה על-ידי יישור עקומות ימינה ושמאלה וחיסור אותות של ערוץ הייחוס השני מאלה של ערוץ הליגנד.
הערה: הנתונים מופעלים ב"לאחר עיבוד" על ידי הגדרת חיישנים באופן חישובי. הוא מוכנס לשכבת על של חיישנים מתאי זרימה שמאליים וימניים, או מיוצגים כחיישנים מההבדל בין שני הערוצים.
- נקו את כל הפלואידיקה עם 50-100 מילימטר גליצין חוצץ pH 9.5, מים, ו 20% אתנול לפני ואחרי מדידות קשירה כדי להסיר עקבות של מלח או כל זיהום חלבון, או מחמיר יותר, עם 0.5% SDS וגליצין.
הערה: כדי למנוע נזק למכשיר, מומלץ לבדוק את היציבות המכנית של שבב הזכוכית לפני הכנסתו מחדש של שבב השבב למכשיר אם השבבים אוחסנו תחת חיץ או בלחות של 100%.
טבלה 1: נתונים קינטיים שהתקבלו מחיישני SPR עבור קשירה של גרסאות הקשר CVN2L0 ו- Cys-Cys V2, V4 ו- V5 ל- HA באמצעות מודל קישור Langmuir 1:1. KD [M] = koff/kon או kd/ka. כל הנתונים מופקים ב-25°C במאגר HBS-EP(+).
| אנליט | kעל [M-1*s-1] | K כבוי [S-1] | קד |
| CVN2L0 | 5.1 ה3 | 1.3 E-3 | 255 נאנומטר |
| V2 | 4.0 ה3 | 1.1 E-3 | 275 נאנומטר |
| V4 | 1.2 ה3 | 1.3 E-3 | 11 מיקרומטר |
| V5 | 1.2 ה3 | 5.8 E-2 | 5 מיקרומטר |
