תהודה מגנטית גרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית

תקציר

מקור: Winkelaar, G., et al. מדידת אינטראקציות של חלבונים כדוריים ופילמנטיים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ותרמופורזה מיקרוסקולית (MST). J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בין ¹⁵חלבוני אנבופלקין מסוג פרא ומוטציה המסומנים N לבין חלבון וימנטין ללא תווית. האינטראקציה המוצלחת בין אנבופלקין פראי לווימנטין מובילה להרחבת קווים נרחבת ולהיעלמות שיא בספקטרום ה-NMR, בעוד שהיעדר אינטראקציה בין האנבופלקין המוטציה לווימנטין מביא לשיאים פתורים היטב בספקטרום ה-NMR.

פרוטוקול

1. שיטות NMR

1. הכנת דגימת תמ"ג
   1. לטהר ¹⁵חלבון מסוג פרא או R1914E E-PRD עם תווית N באמצעות 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. תמיסות מלאי חלבונים נעות בדרך כלל בין 0.3 ל -1 מילימטר עם נפחים של כ -1 מ"ל
      הערה: ניתן לרכז את החלבון עד >100 מיקרומטר באמצעות מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי MWCO 3 kDa, 5 מ"ל כדי להביא את הריכוז לטווח מתאים להכנת דגימה.
   2. לטהר דגימה של חלבון VimRod ללא תווית באמצעות 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7.
   3. בנפח סופי של 500 μL, הוסף חלבון E-PRD פראי או מוטנטי לריכוז סופי של 100μM, תחמוצת דאוטריום (D₂O) לריכוז סופי של 10% (v/v), ו- DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic Acid) לריכוז סופי של 20 μM. הבא את נפח הדגימה עד 500 μL באמצעות 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, ו- pH 7. הכנת מדגם מייצג מתוארת בטבלה 1.
      הערה: תהודה 0 ppm של DSS משמשת לכיול השינויים הכימיים של ¹H וכן להתייחסות עקיפה של ¹⁵N שינויים כימיים של החלבון. D₂O משמש לאות נעילת הדאוטריום כדי לשמור על הספקטרומטר פועל בשדה מגנטי נטו קבוע.
   4. הרכיבו דגימה שנייה של E-PRD, D₂O ו-DSS כמו בשלב הקודם והוסיפו את VimRod לריכוז סופי של 50 מיקרומטר לפני העלאת הנפח ל-500 מיקרוליטר.
   5. העבירו את דגימות 500 μL לצינורות NMR ברוחב 5 מ"מ לצורך הניסוי.

2. NMR Experimental Setup

1. הפעל את זרימת האוויר עם פקודת השליפה "ej"; פעולה זו תביא את הדגימה מהמגנט. כעת, מקם את הדגימה בתוך ספינר על גבי המגנט על ידי הפתח והכנס אותו עם הפקודה "ij". המתינו עד שהדגימה תשקע בתוך המגנט לפני שתמשיכו.
2. צור מערך נתונים חדש באמצעות הפקודה "edc" וטען פרמטרים סטנדרטיים של 1 H NMR על-ידי בחירת ניסוי "ZGPR" (איור 1). מלא את השדות NAME, EXPNO (מספר ניסוי) ו- PROCNO (מספר תיקיית נתונים מעובדים). בחר את הממס בשדה "הגדר ממס" ולחץ על "ביצוע 'getprosol'" כדי לקרוא את ראש הבדיקה הסטנדרטי ואת הפרמטרים תלויים ממס (prosol).
3. נעל את הדגימה לממס המפורק, כלומר D₂O, באמצעות הפקודה "נעל" והמתן עד שהיא מסיימת לטאטא ומשיגה נעילה.
4. תקן את תדר התהודה של המגנט על ידי כוונון הדגימה באמצעות פקודת הכוונון האוטומטית "atma". נטר את עקומת הנדנוד עד להשלמת הכוונון האוטומטי.
5. Shim את השדה המגנטי באמצעות TOPSHIM (הפקודה "topshim"). שיימינג הוא תהליך של התאמות לשדה מגנטי כדי להשיג אחידות סביב הדגימה. זה נוהג טוב לאחסן את ערכי shim עם הפקודה "wsh" ולקרוא אותם באמצעות "rsh" לפני topshim, אם באמצעות דגימות זהות או דומות.
6. התאם את רווח המקלט באמצעות פקודת "rga" כדי להשיג יחס אות לרעש מרבי.
7. מקם את מרכז הספקטרום על קיזוז תהודת המים (o1) וקבע את פולס הפרוטון של 90 מעלות (p1) בהספק גבוה באמצעות "calibo1p1".
8. אסוף את ספקטרום הפרוטון באמצעות הפקודה והתהליך "zg" של אפס ללכת עם "efp" הכולל כפל מעריכי ("em"), דעיכת אינדוקציה חופשית (FID) המשלבת הרחבת קו, טרנספורמציית פורייה "ft" של FID ו- "pk" כדי להחיל תיקון פאזה.
9. החל את תיקון הפאזה האוטומטי "apk" ואת תיקון הבסיס האוטומטי "absn" באמצעות פולינום ללא אינטגרציה אופציה.
10. צור ערכת נתונים חדשה (כמו ב- 1.2.2) עבור ניסוי SOFAST HMQC על ידי בחירת "SFHMQC3GPPH" בניסוי.
11. העתק P1 ו- O1 ממוטבים מספקטרום פרוטונים ואכלס פולסים תלויי P1 באמצעות הפקודה "getprosol 1H p1 plw1", כאשר p1 הוא ערך P1 הממוטב ו- plw1 היא רמת ההספק עבור P1.
12. מטב את קבוע CNST54 כדי להגדיר את ההיסט עבור הסטה כימית של אמיד ואת CNST55 כדי להגדיר את רוחב הפס כדי להקיף את אזורי העניין הספקטרליים המאפשרים אופטימיזציה של רווח המקלט (איור 2). כדי לבחור פרמטרים אלה, חלץ את ה- FID הראשון (דעיכת אינדוקציה חופשית) מהספקטרום הדו-ממדי וחפש את האות הנצפה כדי להגדיר אותם. בנוסף, שנה את עיכוב ההרפיה (D1), מספר הסריקות (NS) וסריקות דמה (DS) כדי לקבל רגישות אות מקובלת עם הפקודה "gs", המאפשרת ללכת ולסרוק כדי לנטר את איכות הנתונים בזמן אמת.
13. הקלט את הספקטרום באמצעות Zero Go "zg".

טבלה 1. הכנת מדגם NMR.

לדוגמה	1 mM E-PRD במאגר A (μL)	1mM VimRod בחיץ A1 (μL)	חיץ A (μL)	DSS של 200 מיקרומטר ב-D2O (μL)	חיץ B2 (μL)	נפח כולל (μL)
E-PRD בלבד	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1חיץ A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2חיץ B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

תוצאות

איור 1: לכידת מסך של מערך ניסוי ה-NMR. החלון המוצג משמש להגדרת ניסוי סטנדרטי לאיסוף ערכת נתונים HSQC. פרמטרי הניסוי נקראים בסמוך לניסוי. ניסוי ZGPR המוצג נבחר כניסוי ראשוני לטעינת פרמטרי פרוטון סטנדרטיים ותלויי ממס. החלון כותרת משמש להזנת פרטים ניסיוניים למטרות שמירת רשומות. כדי לאסוף את ספקטרום HSQC, ניסוי ZGPR מוחלף ב- SFHMQC3GPPH.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמוניום כלורי (15N, 99%)	מעבדות האיזוטופים של קיימברידג'	NLM-467	תיוג איזוטופים עבור NMR
D2O, תחמוצת דאוטריום (D, 99.8%)	מעבדות האיזוטופים של קיימברידג'	DLM-2259	הכנת דגימת תמ"ג
DSS, נתרן 2,2-דימתיל-2- סילפנטאן-5-סולפונט-D6 (D,98%)	מעבדות האיזוטופים של קיימברידג'	DLM-8206	סימוכין עבור NMR
צינורות NMR מדויקים בקוטר 5 מ"מ, באורך 7 אינץ'	SJM/Deuterotubes	בורואקו-5-7	צינורות NMR
ספקטרומטר NMR (14.1 טסלה)	ברוקר		רכישת נתוני NMR
בדיקה קריוגנית TCI 5mm z-PFG	ברוקר		רכישת נתוני NMR
תוכנה
Bruker TopSpin 4.0.1	ברוקר		עיבוד נתוני תמ"

ג