שימוש בתצוגת פאגים לבחירת חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון מטרה

תקציר

מקור: Zhang, W., et al., שימוש בתצוגת פאגים לפיתוח אפנן גרסאות יוביקוויטין עבור ליגזות E3. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה אנו מדגימים את טכניקת תצוגת הפאגים לבידוד פאגים מהונדסים מראש המבטאים חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון המטרה.

פרוטוקול

1. הכנת ספריית הפאגים

1. הפשירו את ספריית הפאג'ים על קרח ודללו אותה עד פי 100 ממגוון הספריות ב-PBS. לדוגמה, אם מגוון הספרייה הוא 1 x 10¹⁰ וריכוז הספרייה הוא 1 x 10¹³, דלל את הספרייה כך שהריכוז יהיה 1 x 10¹². עבור הספריות המשמשות כאן, לדלל אותם פי 10 ב- PBS על ידי שילוב של 1 מ"ל של הספרייה עם 9 מ"ל של PBS.
   הערה: גיוון הספרייה היה צריך להיקבע במהלך יצירת הספרייה ולא ניתן להעריך אותו בקלות אחרת. ניתן לקבוע את ריכוז הספרייה על ידי חיסון תאי E. coli בשלב האמצע (OD600 0.6 - 0.8) וציפוי על LB/carb.
2. הוסף 1/5 אמצעי אחסון של PEG/NaCl. לדוגמה, עבור 10 מ"ל של הספרייה המדוללת בעבר, הוסף 2 מ"ל של PEG/NaCl.
3. דוגרים על קרח במשך 30 דקות.
4. צנטריפוגה ב 11,000 x גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant, וצנטריפוגה מחדש במשך 2 דקות כדי למשוך למטה את supernatant הנותר.
   הערה: שים את הצינור ברוטור באותו כיוון בפעם השנייה כפי שהיה הראשון לשמור את הגלולה באותו מקום, ולכן, מה שהופך אותו קל יותר לראות.
5. יש להשהות מחדש בעדינות את כדורית הפאג' ב-1 מ"ל PBT לכל חלבון. עבור ארבעה חלבונים, להשעות מחדש את הגלולה ב 4 מ"ל של PBT.
   הערה: נסו לא לגעת בגלולה ואל תכניסו בועות אוויר.

2. הצגת פאגים לחלבוני המטרה

1. בקרה אופציונלית: הוסף 100 μL של ספריית פאגים לכל אחד המצופים היטב בלוח הבקרה. דוגרים בטמפרטורת החדר (~ 20-25 מעלות צלזיוס) למשך שעה אחת עם רעידות מסלוליות של 300 סל"ד ומעבירים את הספרייה מלוח הבקרה לצלחת המטרה.
2. הסר את חיץ PB מלוח המטרה והוסף 100 μL של ספריית הפאגים לכל באר מצופה.
3. יש לדגור בטמפרטורת החדר (~ 20-25 מעלות צלזיוס) למשך שעה אחת עם רעידות מסלוליות של 300 סל"ד.

3. לעגל פאג אחד

1. הסר את ספריית הפאגים ושטוף את הבארות המצופות ארבע פעמים עם חיץ PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את הטיפות האחרונות.
   הערה: אם חלבוני מטרה מרובים מצופים בצלחת אחת, נסו למזער את זרימת כל התמיסות הבאות בין הבארות.
2. הוסיפו 100 μL של 0.1 M HCl לכל באר מצופה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות עם רעידות מסלוליות של 300 סל"ד.
3. נטרל את ה- pH על ידי הוספת 12.5 μL של 1 M Tris-HCl (pH 11) לכל באר מצופה.
4. אגרו את הפאג' המדולל מכל 8 הבארות לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד בנפח 1.5 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך את הפתרונות הומוגניים לשאוף את כל הנוזלים מהבארות.
5. הוסף 10% BSA לפאג המדולל המאוגד לריכוז סופי של 1%. לקבלת נפח אלוציה עגול טיפוסי של 950 μL, הוסף 95 μL של 10% BSA. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. זהו הפלט העגול הראשון.

4. הכנה לסבבי הבחירה הבאים

1. הכינו תרבית זרעים לתרבית קלט הפאגים לסבב הבחירה הבא כמו בשלב 1.1.
2. צפו את הצלחת בסבב הבחירה השלישי כמו בשלב 1.2 עם השינויים המפורטים להלן.
   1. יש לצפות רק ארבע בארות לכל חלבון בצלחת קשירה של 96 בארות. השתמש במחצית התוכן של צינורות "עגול 2/3" או "עגול 4/5" עבור הסיבוב המתאים. יש לדלל את תכולת הצינורות לפי הצורך, על מנת למנוע שקיעה של חלבונים מחוץ לתמיסה.
3. הכינו את קלט הפאגים לסבב הבחירה הבא.
   1. השתמש במחצית מהפלט העגול כדי לחסן 3 מ"ל של תאי שלב אמצע לוג. לקבלת פלט עגול טיפוסי, יש לחסן עם 500 μL מהפלט.
   2. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות עם רעידות מסלוליות של 200 סל"ד.
   3. הוסף פאג עוזר M13K07 לריכוז סופי של 1 x^{10 10} PFU/mL.
   4. דגירה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת עם רעידות מסלוליות של 200 סל"ד.
   5. העבר את כל 3 מ"ל התרבית ל- 30 מ"ל של 2YT / פחמימות / קאן. גדל בן לילה ב 37 ° C עם 200 סל"ד רעידות מסלוליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערכת שפופרת מיני Axygen (0.65 מ"ל, סטרילי, 96/ארון תקשורת, 10 ארונות תקשורת/אריזה)	פישר סיינטיפיק	14-222-198	כלי פלסטיק
BD Difco מדיה תרבות מיובשת: LB מרק, מילר (לוריא-ברטני)	פישר סיינטיפיק	DF0446-17-3	הכנת צלחות לטירינג
אלבומין בסרום בקר (BSA), חלק V	BioShop קנדה	michal_1977	רכיב חיץ
מלח דיסודיום קרבניצלין 89.0-100.5% נטול מים	מיליפור-סיגמא	C1389-5G	גידול תאים נגועים בפאגמיד
שייקר Microplate דיגיטלי קומפקטי	פישר סיינטיפיק	11-676-337	מכשיר
סרט איטום אלומיניום Corning Microplate	פישר סיינטיפיק	07-200-684	איטום מלאי גליצרול פאגים
אגר מיובש	פישר סיינטיפיק	DF0140-01-0	הכנת צלחות לטירינג
DS-11 ספקטרופוטומטר/פלואורומטר	DeNovix	DS-11 FX+	מכשיר
גריינר Bio-One CellStar 96-ובכן, לא מטופל, בצורת U תחתית	פישר סיינטיפיק	7000133	כלי פלסטיק
חומצה הידרוכלורית	פישר סיינטיפיק	A144-500	כימי
Invitrogen ירייה אחת OmniMAX 2 T1R כשיר כימית E. coli	פישר סיינטיפיק	C854003	זן חיידקי לזיהום פאגים
קנמיצין סולפט	פישר סיינטיפיק	AAJ1792406	גידול M13K07 עוזר תאים נגועים בפאגים
פאג עוזר M13KO7	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	N0315S	התרת אריזה והפרשה פגמידיים
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	פישר סיינטיפיק	11-676-076	מכשיר
Nunc MaxiSorp 96-well microplate, תחתית שטוחה	לייף טכנולוגיות	44-2404-21	כלי פלסטיק
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 10X	פישר סיינטיפיק	BP3994	רכיב חיץ/מדיום מתלה פאגים
סרטי פוליאסטר עבור ELISA ואינקובציה	VWR	60941-120	כיסוי המיקרו-צלחות במהלך הדגירה
פוליאתילן גליקול 8000 (PEG)	פישר סיינטיפיק	BP233-1	משקעי פאג
נתרן כלורי	מיליפור-סיגמא	S3014	משקעי פאג
צינורות תרבות פלסטיק סטריליים: פוליפרופילן שקוף	פישר סיינטיפיק	14-956-1D	תרבית תשומות פאגים
טטרציקלין הידרוכלוריד	פישר סיינטיפיק	BP912-100	גידול תאי E. coli OmniMax
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP1525	נטרול תמיסת פאגים מדוללים
אבקת טריפטון	פישר סיינטיפיק	BP1421-2	רכיב מדיה לצמיחת תאים
טווין 20	פישר סיינטיפיק	BP337500	רכיב חיץ
תמצית שמרים	פישר סיינטיפיק	BP1422-2	רכיב מדיה לצמיחת תאים