ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים

1. FKBP12 F36V -mVenus טיהור

1. התמרת תאי pLysS (DE3) עם וקטור pET22b המכיל FKBP12F36V12 אנושי מונומרי ותגי N-terminal His6 ו-mVenus (וקטור זמין לפי בקשה). תאי צלחת על אגר LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ו 34 מיקרוגרם / מ"ל Chloramphenicol.
2. העבר מושבות שהפכו לתרבית סטרטר של 100 מ"ל LB וגדל במשך 16 - 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות.
3. לדלל תרבית התחלה צפופה (OD600 >1) 1:100 ב- LB בינוני (2 x 500 מ"ל אצוות) ולגדול במשך 2 - 3 שעות עד OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 סל"ד).
4. תרבויות מגניבות על קרח. יש להשרות עם IPTG של 250 מיקרומטר ולגדול במשך 16 - 20 שעות ב-21°C, 200 סל"ד.
5. קצרו תאים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 2,000 x גרם למשך 20 דקות.
6. גלולת השהיה ב-40 מ"ל של חיץ IMAC A (20 מ"מ נתרן פוספט pH 7.5, 500 מ"מ NaCl, 3 מ"מ אימידזול, 1 מ"מ β-מרקפטואתנול) בתוספת מעכבי פרוטאז נטולי EDTA (טבליה אחת לכל גלולה בתא).
7. סוניק תאים (500 וואט, 20 קילוהרץ, 40% משרעת, 9 שניות על, 11 שניות כיבוי למשך 15 דקות) על קרח וקצור חומר מסיס באמצעות צנטריפוגה במהירות של 20,000 x גרם.
8. מעבירים ליזט מסיס לבקבוק חרוטי ומוסיפים 2 מ"ל שרף (ראו טבלת חומרים). דגירה במשך שעה עם סיבוב 105 סל"ד
   הערה: ניקל ספרוז עשוי לשמש גם לשלב IMAC זה.
9. קצור שרף ושטיפה עם 250 מ"ל של חיץ IMAC A ואחריו 500 מ"ל של מאגר IMAC B (20 mM נתרן פוספט pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol).
   הערה: הגדל ל 50 mM imidazole אם אתה משתמש שרף ניקל sepharose.
10. Elute His6-tagged חלבון באמצעות IMAC buffer C (20 mM נתרן פוספט pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol).
11. יש להזריק על עמודת אי-הכללת גודל (ראה טבלת חומרים) המקבילה ל-10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl ו-1 mM DTT. FKBP12F36V יש את שיא האלוציה שלה ב 87.71 מ"ל על העמודה בה השתמשנו.
12. יש להעריך את הטוהר באמצעות SDS-PAGE ובריכה ולרכז לפי הצורך.

2. הכנת מערך לוחות Multiwell

1. הפשירו את FKBP12F36V המטוהרים (או החלבון המסומן כמעניין) מ-80°C-.
2. הכן תמיסה של 100 ננומטר מטוהר FKBP12F36V (בינוני, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). סוניקט וצנטריפוגה (סיבוב מהיר של 13,000 סל"ד) למניעת היווצרות אגרגטים.
3. פיפטה 100 - 200 μL לתוך תא תצפית 8 בארות עם תחתית זכוכית.
4. הוסף את דימריזר BB לריכוזים סופיים של 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ו- 500 ננומטר.
5. כהפניה, הכינו תמיסה של 100 ננומטר של mVenus בלבד כדי להעריך השפעות צבירה ומשקעים פוטנציאליות ולשחזר ערך בהירות עבור המונומר עם אותן הגדרות רכישה.

3. רכישה קונפוקלית ללא כיול

1. הפעל את המערכת הקונפוקלית (איור 1). כל מערכת קונפוקלית של מיקרוסקופ סריקת אור המצוידת בגלאים דיגיטליים או גלאים אנלוגיים מאופיינים היטב, ומסוגלת לשמור על זמן שהייה קבוע לכל פיקסל שנרכש תעבוד.
2. הגדר את נתיב קרן העירור:
   1. הפעל את לייזר 514 ננומטר ולהגדיר אותו על 20 - 100 nW כוח ביציאה של המטרה (עבור FKBP12F36V-mVenus).
   2. בחר את המטרה 63X1.4NA או את המטרה טבילה במים לתיקון צווארון המיועדת ל- FCS.
   3. הפעל גלאי HyD, APD או PMT מכויל אחד. גלאים המסוגלים לספור פוטונים עדיפים, שכן במקרה זה, חישוב של S, היסט σ₀² מיותר.
   4. בחר את חלון הפליטה בין 520 - 560 ננומטר
   5. הגדר את חור הסיכה על 1 יחידה אוורירית עבור הפליטה המתאימה ~ 545 ננומטר.
   6. הגדר את מצב הרכישה ל- 16 x 16 פיקסלים
   7. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים כך שהוא יקיים את t_מסגרת >>- T_D >> t_לשכון, כאשר T_D הוא זמן המגורים של החלבון המפזר ו- t_מסגרת הוא קצב המסגרות. זה התאים להגדרת זמן השהייה ל~ 13 μs.
      הערה: לחלק מהיצרנים המסחריים היו סורקים שלא שמרו על זמן השהייה קבוע לפיקסל. קביעות זו חיונית להצלחת השיטה.
   8. הגדר את גודל הפיקסל ל~120 ננומטר.
   9. בחר את מצב הרכישה xyt ובחר את מספר המסגרות שיש לרכוש בכל רכישה ובאר (לדוגמה, 5,000).
   10. אם המערכת מצוידת במצב תפוקה גבוהה, הצג את הקואורדינטות של כל באר ואת מספר הרכישות לכל באר כדי להפוך את התהליך לאוטומטי.
       הערה: היזהר להבטיח את נוכחותו של מתקן מים אם אתה משתמש במטרה טבילה.
   11. אם המערכת מצוידת במערכת זילוח, טען את פתרון BB ותכנת את הזילוח להתחיל מיד לאחר הפריים ה^-5000 כדי להעריך את הקינטיקה של דימריזציה תוך רכישת למשל 10,000 תמונות.
3. הוסף טיפת שמן למטרת טבילת השמן/מים אם אתה משתמש במטרה טבילה במים לתיקון קולר המיועדת ל- FCS.
4. הר את חדר התצפית בן 8 הבארות על הבמה.
5. בחר את הבאר הנכונה והתמקד בפתרון.
   הערה: חשוב: הימנע מהתמקדות קרוב לזכוכית התחתונה כדי למנוע השתקפות ופיזור. כאשר מתמקדים עמוק יותר בפתרון, נתק את אפשרות המיקוד האוטומטי.
6. התחל את הרכישה ושמור את ערימת התמונות המתקבלת בתבנית TIFF.

4. ניתוח מגמות ובהירות באמצעות חבילת R nandb

1. כבדיקת איכות קדם-עיבוד, השתמשו ב-ImageJ כדי להתבונן בתמונות ולשחזר את פרופיל העוצמה, כפי שמוצג באיור 2a. זה שימושי כדי לקבוע אם יותר מדי photobleaching התרחש או לא. אם יש יותר מדי הלבנה, הנתונים אינם מתאימים לניתוח נוסף.
   הערה: ImageJ יכול גם להיות שימושי להמרת תמונות ל- TIFF מפורמטים מסחריים. תוכנת nandb המתוארת להלן יכולה לעבוד רק עם קבצי TIFF.
2. הורד והתקן את R ו- RStudio. עדיף להוריד ולהתקין R הראשון, ולאחר מכן RStudio.
   הערה: להלן תיאור של אופן השימוש בחבילת nandb R. הידע של שפת R אינו נדרש להשתמש nandb, עם זאת, זה יעשה את החיים קלים יותר.
3. התקן את חבילת nandb.
   1. פתח את RStudio ובמסוף, הקלד install.packages("nandb") והמתן להתקנה.
4. הכירו את nandb
   1. עיין במדריך.
   2. סקור את העזרה המובנית של RStudio עבור פונקציות שונות. הפונקציה הסבירה ביותר לשימוש תהיה בהירות(). הצג את קובץ העזרה עבור פונקציה זו על-ידי הקלדת ? בהירות () בקונסולה.
5. חישוב בהירות
   1. נניח שיש קובץ תמונה בשולחן העבודה שנקרא img001.tif (שים לב ש- 'nandb' עובד רק עם קבצי TIFF). ניתן לחשב את בהירות התמונה:
      b <- בהירות("~/Desktop/img001.tif", tau = "אוטומטי")
      1. פעולה זו מקצה את בהירות התמונה למשתנה b ב- R. tau = "auto" מבטיח שהתמונה תבוטל כראוי לפני חישוב הבהירות. הדבר הנפוץ ביותר לעשות מכאן הוא לחשב את הבהירות הממוצעת או החציונית של התמונה. ניתן לעשות זאת על ידי הקלדת mean(b) או median(b). ניתן גם לכתוב את תמונת הבהירות על שולחן העבודה באמצעות
         ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. נניח שיש לאדם תיקייה מלאה בתמונות images_folder על שולחן העבודה והוא צריך לחשב את הבהירות של התמונות האלה ולכתוב את תמונות הבהירות כקבצי TIFF. לאחר מכן ראה ?brightness_folder(). פונקציה זו מעבדת תיקייה שלמה בבת אחת:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      זה טוב במיוחד עבור אלה שיש להם תוכנה שהם מעדיפים R כי כל הקבצים מעובדים בפקודה אחת, ולאחר מכן אחד יכול להמשיך לעבוד עם בהירות פלט תמונות TIFF בתוכנה הנבחרת שלהם, בין אם זה ImageJ, Python, או משהו אחר.

איור 1. יישום N&B לזיהוי מעברי מונומר-דימר חלבוני בתמיסה. (א) נתיב אופטי מפושט של מיקרוסקופ סריקת לייזר (LSM) המצויד במקור לייזר (מוגדר על 514 ננומטר במקרה של חלבונים המסומנים על ידי mVenus) המכוון (חיצים כחולים) לעבר מטרת טבילה (במקרה שלנו שמן 63X1.4NA) המאירה תמיסה של 100 ננומטר של תמיסת FKBP12F36V-mVenus. פלואורסצנטיות הפליטה (חיצים ירוקים) עוברת דרך מראה דיכרואית ומכוונת לעבר מסנן פסים המנקה את אור הפליטה, וחור סיכה המוגדר ביחידה אוורירית אחת הממוקמת ממש לפני גלאי דיגיטלי נקודתי המסוגל לספור פוטונים. (b) נפח קונפוקלי של הארה נסרק דרך 16 x 16 פיקסלים המאירים מולקולות בודדות של FKBP12F36V-mVenus הנכנסות ויוצאות מנפח קונפוקלי בצורת גאוס ומייצרות מערך של תנודות בעוצמת הפלואורסצנטיות. (ג) סדרות תמונות שנרכשו לאורך זמן

איור 2. יש צורך בדה-טרנינג אוטומטי כדי למדוד במדויק אוכלוסייה של מונומרים בתמיסה. (א) נרכשה ערימה של 5000 תמונות בגודל 16 x 16 פיקסלים כמתואר בסעיף הפרוטוקול. עוצמת הפריים הראשון מוצגת יחד עם פרופיל העוצמה הממוצע שנקבע בזמן, אשר מראה תנודות ארוכות טווח שעשויות להיות קשורות להלבנה ולהשפעות ממס ו/או פוטופיסיות אחרות. תהיה הסיבה לתנודות ארוכות טווח אלה אשר תהיה, הן משפיעות על חישובי הבהירות ולכן דורשות דה-מגמה. ללא detrending אוטומטי, אחד מקבל B = 1.026, בעוד לאחר detrending אוטומטי, B = 1.005. כמו כן, הבהירות ללא (לוחות שמאליים, שורה שנייה) ועם (פאנלים ימניים, שורה שנייה) סינון חלק מוצגת. (ב) אותם נתונים שהוצגו ב-(א) היו במגמת ירידה והתוצאות במונחים של עוצמה ובהירות הוצגו.