$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. שיבוט
- קבע את התצורות לשכפול ובחר מקשר. תייגו חלבונים עם המקטעים במסוף N או C כמתואר להלן כדי שלא יפריעו ללוקליזציה התקינה שלהם. השתמש במקשר גמיש כגון (GGGGS)x2.
- תייגו גנטית את החלבונים המעניינים את מקטעי PAmCherry1. כאפשרות אחת, השתמש בפלסמידים המשובטים המפורטים ברשימת החומרים המכילה את השברים RN (שאריות PAmCherry1 1-159) ו- RC (Met בתוספת שאריות PAmCherry1 160-236) עם רצפי MCS צמודים.
- לינאריות את הפלסמידים המכילים את השברים RN ו- RC עם PCR הפוך (או תקציר הגבלה) בנקודת ההחדרה. פריימרים עבור PCR הפוך מפורטים בטבלה 1. להלן פרוטוקול PCR לדוגמה המשמש במעבדה של המחבר (ראה רשימת חומרים עבור החומרים המדויקים המשמשים בפרוטוקול זה).
- מערבבים את תגובת ה-PCR יחד, ומביאים עד לנפח סופי של 50 μl עם מים: לצינור PCR בעל דופן דקה, מוסיפים את המים, 25 μl של 2x Master Mix, 0.5 μl כל אחד מהפריימרים קדימה ואחורה (20 μM מלאי מדולל, ריכוז סופי של 0.2 μM), ו-1 ng של תבנית. השתמש בתנאי הרכיבה הבאים: 98°C למשך 30 שניות, 30 מחזורים של 98°C למשך 7 שניות ו-68°C למשך 2 דקות, והארכה סופית ב-72°C למשך 10 דקות.
- PCR הגנים המעניינים להחדרה לפלסמידים ליניאריים המכילים מקטעי RN ו- RC. בצע את ה- PCR כמו בשלב 1.2.1 עם זמן ההארכה ב- 68 ° C. השתמש בפריימרים עם שלוחות המכילות רצף מקשר גמיש, כגון GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT עבור (GGGGS)x2, והומולוגיה של 15 זוגות בסיסים לקצות פלסמידים RN ו- RC ליניאריים עבור רקומבינציה.
הערה: הפריימר של החלבונים המעניינים מוצג בטבלה 2 אם משתמשים בפריימרים בטבלה 1 כדי ליצור ליניאריזציה של עמוד השדרה של הפלסמיד.
- לעכל את תגובת PCR עם Dpn1 כדי לחסל את תבנית PCR. הוסף 0.5 μl של Dpn1 (20 U/μl) ישירות ל- 50 μl של תגובת PCR. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ולהשבית את החום בטמפרטורה של 80°C למשך 20 דקות. אם תבנית הרקע נמשכת בשלבים מאוחרים יותר, הגדילו את כמות האנזים או האריכו את זמן העיכול.
- לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות עמודת ספין כמתואר על-ידי היצרן.
- בצע תגובה בלתי תלויה בקשירה כדי לשלב פלסמיד ליניארי המכיל מקטע RN או RC עם הגן המעניין. למדוד את הריכוז של מוצרי PCR מטוהרים: לשלב 50 ng של פלסמיד ליניארי ו 50 ng של הגן של עניין עם 1 μl של premix אנזים ולהביא את נפח הכולל ל 5 μl עם מים deionized. יש לדגור בטמפרטורה של 50°C למשך 15 דקות, להניח על קרח ולהוסיף 20 μl של מאגר TE.
- הפוך פלסמידים רקומביננטיים לחיידקים מוכשרים.
- בחר 2-4+ (לפי הצורך) מושבות עבור תרבות O/N. הוסיפו 5 מ"ל מרק LB ו-5 מיקרוליטר קנמיצין (50 מ"ג/מ"ל מלאי) לצינורית פוליפרופילן עגולה בתחתית עגולה של 14 מ"ל, והוסיפו את מושבת החיידקים שנבחרה עם לולאת חיסון מעוקרת. יש לדגור ב-37°C O/N תוך כדי רעידות ב-225 סל"ד.
- יש להקפיא 1 מ"ל של תרבית O/N למלאי גליצרול ולמזער את השאר כמתואר על ידי היצרן.
- בצע רצף כדי לקבוע שיבוט טוב. אם אתם משתמשים בפלסמידים המשובטים ברשימת החומרים, השתמשו בפריימרים M13 קדימה ואחורה (בתגובות נפרדות) לפי הצורך כדי לקבל את הרצף המלא של מבנה האיחוי. השווה עם הרצף הצפוי באמצעות כלי יישור כגון BLAST מהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- העבר את המבנים המאומתים ברצף לפלסמיד ביטוי באמצעות תגובת רקומבינאז.
- הוסף 75 ng של פלסמיד היעד - כגון pcDNA עבור transfections חולפות או pLenti עבור אריזה lentiviral - ו 50 ng של פלסמיד שיבוט רקומביננטי ל 1 μl של premix אנזים ולהביא את הנפח הכולל ל 5 μl עם מים deionized. יש לדגור בטמפרטורה של 25°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן להוסיף 5 μl של TE buffer.
הערה: עבור אריזה lentiviral ויצירת קו תאים יציב, להשתמש פלסמיד יעד שונה עבור כל מבנה, למשל, אחד עם עמידות puromycin והשני עם neomycin. זה מאפשר בחירה כפולה של תאים מתומרים. שקול גם את המקדם עבור כל אחד מהם, כגון מקדם cytomegalovirus (CMV) מכונן עבור רמות ביטוי גבוהות, או CMV עם אופרטור TetO עבור ביטוי מווסת דוקסיציקלין.
- הפוך 5 μl לחיידקים מוכשרים ומינימום את הפלסמידים כמו בשלבים 1.2.6 עד 1.2.8, אך באמצעות אנטיביוטיקה מתאימה (בדרך כלל אמפיצילין).
- קבע את תצורת BiFC האופטימלית.
- פלסמידים של ביטוי Co-transfect לתוך תאי U2OS (או תא לפי בחירה).
- הוסף 350 μl של פנול ללא אדום וללא אנטיביוטיקה DMEM בתוספת 10% FBS לכל באר של 8-well #1.5 זכוכית תחתית תא מגלשה. צלחת על 7.5 x 104 תאים לכל באר כך התאים הם כ 70%-90% מפגש למחרת.
- יום לאחר הציפוי, פלסמידים ביטוי co-transfect עם תצורות שונות בכל באר באמצעות מגיב מועדף כפי שתואר על ידי היצרן.
- עבור כל באר, יש להוסיף 125 ננוגרם של כל פלסמיד ביטוי ל-50 מיקרוליטר של מדיה מופחתת ללא סרום בצינור של 0.6 מ"ל ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. הוסף 1 μl של מגיב transfection במורד מרכז הצינור ישירות לתוך התקשורת. יש לערבב בעדינות ולתת לתגובה לשבת במשך 30 דקות.
- הפחיתו את המדיה בכל באר של שקופית התא בכמחצית. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה טיפה לבארות ומנערים בעדינות לערבוב. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 24-48 שעות. שנה את המדיה ביום שאחרי ההדבקה.
- תמונה של תאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו בפרוטוקול 2 המתחיל בשלב 2.1.4.<br />
הערה: ניתן לצלם את הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי אם רמות הביטוי גבוהות והמצלמה רגישה מספיק לתפוקת הפוטון הנמוכה יחסית של PAmCherry1. מולקולות PAmCherry1 משוחזרות יכולות להיות מופעלות באמצעות מסנן אולטרה סגול (405 ננומטר) לפני הדמיה עם ערכת מסנן עירור ירוק (561 ננומטר).
- במידת הצורך, צור בקרה שלילית על-ידי, למשל, החדרת מוטציה נקודתית לאחד החלבונים המעניינים המשבשים את האינטראקציה. ביצוע מוטגנזה מכוונת אתר על פלסמיד השיבוט של החלבון שעבר מוטציה ושל התצורה שנבחרה.
- צור קו תאים יציב על ידי אריזת המבנים לחלקיקים נגיפיים והדבקת תאי U2OS (או קו תאים לפי בחירה). שקול מערכת ביטוי אינדוקציה (טטרציקלין) כך שניתן יהיה לגרום לביטוי לפני ההדמיה אם אי הפיכות ממושכת של BiFC היא בעיה, או אם רוצים ביטוי מתכוונן.
זהירות: עבודה עם וירוסים מסווגת כרמת בטיחות ביולוגית 2. בעוד הדורות האחרונים של מערכות אריזה ויראליות הפחיתו מאוד את הסבירות לייצר וירוסים בעלי יכולת שכפול, סיכונים מסוימים עדיין קיימים. הפניות ניתן למצוא http://www.cdc.gov/ בטיחות ביולוגית / פרסומים/.
- חזור על שלב 1.2.10 באמצעות וקטור יעד לנטי או רטרו-ויראלי. הגדל את תרבית O/N ל 100 מ"ל עבור midiprep וטוהר גדול יותר של פלסמידים.
- ביום הראשון: צלחת על 2 x 106 293T/17 תאים לתוך צלחת 10 ס"מ עבור כל מבנה להיות ארוז.
- ביום השני: הכינו תגובת טרנספקציה באמצעות מגיב טרנספקציה לפי בחירתכם וכפי שמתואר על ידי היצרן.
- הכינו תערובת מוקדמת של פלסמידים באריזה בריכוזים סופיים של 250 ננוגרם/מיקרוליטר לאריזת פלסמידים 1 ו-2, ו-100 נ"ג/מיקרוליטר לאריזת פלסמיד 3 במים סטריליים. הוסף 10 μl של premix פלסמיד אריזה ו 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד המטרה ל 1 מ"ל של מדיה מופחתת ללא סרום 5 מ"ל פוליפרופילן עגול תחתית צינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. הוסף 20 μl של מגיב transfection במורד מרכז הצינור ישירות לתוך התקשורת.
- יש לערבב בעדינות ולדגור ב-RT במשך 30 דקות. מוציאים כמחצית מהמדיה מהתאים ומוסיפים את תערובת הטרנספקציה בצורה טיפתית. יש לנער בעדינות כדי לערבב ולדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. יש לדגור על 10 מ"ל מדיה לצלחת בצינור כאשר הפקק משוחרר לטמפרטורה ולאיזוןCO2.
- ביום השלישי: החליפו בעדינות את המדיה עם המדיה שלפני הדגירה והחזירו את התאים לאינקובטור. יש לדגור על צינור נוסף של מדיה כשהפקק משוחרר. הערה: סינקטיה, או היווצרות של תאים גדולים מרובי גרעינים, יכולה להיות סימן לכך שהאריזה הולכת טוב. עם זאת, התאים נמצאים במצב שביר וניתן לנתק אותם בקלות. בעת שינוי מדיה, הטה את הפיפטור כך שיהיה אופקי והוסף את המדיה לקצה אחד של הצלחת.
- ביום 4: קצרו את הנגיף על ידי הסרת המדיה עם מזרק וסינון דרך מסנן בגודל נקבוביות 0.45 מיקרומטר לתוך צינור נקי של 50 מ"ל. החלף בעדינות את המדיה במדיה המודגרת מראש.
- ביום 5: יש לקצור שוב כפי שנעשה קודם לכן בשלב 1.5.3.3 ולשלב תסנין משותף לאותה צינורית של 50 מ"ל. מוסיפים 6 מ"ל של רכז וירוסים לכל צינור ומערבבים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות לפחות עד שהנגיף יתפרץ.
הערה: בהתאם לבריאות התאים, ניתן לקצור את הנגיף בפעם השלישית.
- רכז את הנגיף על ידי צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 250 μl של מדיה. וירוסים ניתן להשתמש באופן מיידי עבור זיהום או מאוחסן 50 μl aliquots ב -80 °C למשך עד שנה אחת.
- צלחת על 3 x 105 U2OS תאים (או מטרה) לכל באר לתוך צלחת 6 באר (2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לכל באר) עבור זיהום, כך התאים הם כ 50% confluent בזמן ההדבקה.
- למחרת, להסיר כמחצית המדיה כך כ 1 מ"ל נשאר. להדביק עם 50 μl של וירוס מרוכז עבור כל מבנה. יש להוסיף 1 מיקרוליטר פוליברן (8 מ"ג/מ"ל) לכל באר. יש לדגור ב-37°C וב-5% CO2. החליפו מדיה למחרת ודגרו עוד יום לפני בחירת אנטיביוטיקה.
הערה: כמות הנגיף להוסיף יכולה להשתנות בהתאם לקצב ההדבקה הרצוי. וירוסים יכולים להיות titrated באמצעות qRT-PCR.
- הוסף אנטיביוטיקה כדי לבחור תאים נגועים. בארות נפרדות עם תאים לא נגועים שלא ראו את הנגיף נדרשות כקנריות כדי לבחון את יעילות הבחירה. יש לדגור במשך 2-7 ימים, או עד להשלמת הבחירה.
הערה: ריכוזים יעילים צריכים להיות titrated בהתחלה, אבל הם בדרך כלל 1.0 מיקרוגרם / מ"ל עבור puromycin ו 1.0 מ"ג / מ"ל עבור neomycin.
- הרחיבו את התאים לצלחת גדולה יותר של 10 ס"מ והמשיכו לפרוטוקול 2.
2. הדמיה של תאים קבועים
- הכנת דגימה להדמיה
- נקה שקופית תא תחתונה מזכוכית 8-well #1.5 על ידי הוספת 250 μl של 1 M NaOH למשך שעה לפחות ושטוף ביסודיות עם PBS.
הערה: שקופיות תא לא מטופלות גורמות בדרך כלל לאות רקע גבוה. בנוסף, תאים עשויים להיות רגישים לשאריות NaOH ואי ניקוי יסודי של משטח הזכוכית (עד פי 10 שטיפות) עלול להקשות על הידבקות התא. במידת הצורך, יש לדגור על מגלשת התא הנקי עם PBS O/N לאחר הכביסה. עבור קווי תאים רגישים, ציפוי בצפיפות גבוהה יותר (למשל, במפגש ראשוני של 50%-60%) עשוי לעזור.
- צלחת על 5.5 x 104 של תאי ביטוי יציבים U2OS לכל באר ב 350 μl של פנול אדום ללא DMEM עם 10% FBS כך התאים בריאים ולא over-fluent בעת הדמיה.
- לבצע את הטיפולים הדרושים לניסוי, כגון הוספת טטרציקלין כדי לגרום לביטוי חלבון.
- תקן את התאים מיד לפני ההדמיה.
- לפני הקיבוע, הכינו תמיסת פרפורמאלדהיד טרייה (PFA) — 3.7% PFA ב-1x PHEM עם 0.1% גלוטראלדהיד (GA). עבור תמיסת PFA של 10 מ"ל, שקול 0.37 גרם של PFA והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל מים מזוקקים ו 30 μl של 1 M NaOH ומערבולת. מחממים ב-70°C ומערבלים כל 1-2 דקות עד שה-PFA מומס לחלוטין.
- מעבירים PFA מומס לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומוסיפים 3.8 מ"ל מים מזוקקים, 5 מ"ל 2x PHEM buffer, 20 μl של 25% גלוטראלדהיד ומערבולת לערבוב. במלאי, חיץ PHEM 2x הוא 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA ו- 16 mM MgSO4, עם pH מותאם ל- 7.0 עם 10 M KOH. פתרון קיבוע זה ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך מספר ימים.
זהירות: PFA ו- GA שניהם מסוכנים. הכינו את התמיסה במכסה אדים ולבשו ציוד מגן מתאים בעת הטיפול בשני הכימיקלים. יש להימנע משאיפה או ממגע ישיר עם העור.
- הסר את מדיום הגידול. שטפו במהירות עם 500 μl של PBS והוסיפו 250 μl של קיבוע PFA לכל באר. דגור על התאים במשך 20 דקות ב- RT.
- הסר את קיבוע ה- PFA מהדגימה והוסף 350 μl של PBS או מאגר הדמיה (100 mM Tris עם 30 mM NaCl ו- 20 mM MgCl2, pH 8.5) לכל באר.
- מערבולת חלקיקי זהב 100 ננומטר כדי לפרק אגרגטים ולהוסיף 35 μl לכל באר (דילול סופי פי 10) למעקב אחר סחף שלב במהלך ההדמיה.
- השגת תמונות
- הפעל את המיקרוסקופ. הפעל את הלייזרים 405 ו- 561 ננומטר, אך השאר את התריסים (פנימיים או חיצוניים) סגורים בשלב זה. הפעל את מצלמת EMCCD ואפשר לה להתקרר. ודא שהמסננים של 561 ננומטר נמצאים במקומם.
- פתח את תוכנת הרכישה והגדר את זמן החשיפה ל- 100 msec ואת רווח EMCCD ל- 300 (טווח 1 - 1,000).
- מוסיפים שמן טבילה למטרה ומאבטחים את הדגימה לשלב המיקרוסקופ.
- עם שדה בהיר או לייזר 561 ננומטר מופעל (~ 1 קילוואט / ס"מ2 ), להביא את הדגימה למיקוד.
- להדמיית Ras וחלבוני ממברנה אחרים, השתמש במטרה 60X apochromat TIRF עם צמצם מספרי של 1.49 והבא את המיקרוסקופ לתצורת TIRF. התאם את לייזר העירור כך שהוא לא ממורכז בעת פגיעה בצמצם האחורי של מטרת TIRF; זה גורם ללייזר להסיט עם הגעתו לדגימה. המשך לכוונן את הלייזר עד שתגיע לזווית הקריטית והלייזר יוחזר בחזרה. חפש תא לתמונה עם מספר חלקיקי זהב בתצוגה. הגדר אזור עניין התוחם את התא (או אזור בתוך התא) ואת חלקיקי הזהב.
הערה: TIRF מקטין את עומק החדירה של לייזר העירור ומפחית את אות הרקע שאינו ממוקד. בנוסף, תיקון סחף עשוי להיות מדויק יותר כאשר יותר חלקיקי זהב נמצאים בתצוגה.
- אם זמין, הפעילו את מערכת המיקוד האוטומטי כדי לתקן סטיית דגימה בכיוון z. אחרת, התאימו את המיקוד ידנית לאורך כל הרכישה אם התמונה יוצאת מהמיקוד.
- התחל לרכוש כאשר הלייזר של 405 ננומטר כבוי והלייזר של 561 ננומטר מופעל (~ 1 קילוואט/ס"מ2) במקרה שכבר מתרחשת הפעלה מספקת (בדרך כלל אם רמות הביטוי גבוהות). אחרת, הפעל את הלייזר של 405 ננומטר בהגדרת ההספק הנמוכה ביותר של היצרן (0.02 mW או 0.01 W/cm2) והגדל בהדרגה (0.1 mW בכל פעם) לפי הצורך עד שיהיו כמה עשרות מולקולות לכל מסגרת או כך שמולקולות בודדות מופרדות היטב.
- ככל שאיסוף הנתונים נמשך, הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר של 405 ננומטר כדי לשמור על צפיפות הספוט קבועה בערך. הערה: בעוצמת עירור נמוכה יותר של 405 ננומטר, חלק מ-PAmCherry1 כבר יכול להיות מופעל. ככל שמולקולות אלה עוברות פוטו-אקונומיקה, אוכלוסיית מולקולות PAmCherry1 הנותרות ניתנות לפוטו-אקטיבציה פוחתת, מה שדורש שטף פוטונים גבוה יותר כדי לשמור על אותה צפיפות של מולקולות הפולטות פלואורסצנטיות בכל מסגרת.
- המשך ברכישת תמונה עד להספק גבוה של 405 ננומטר (2.5 – 10 ואט/ס"מ2) שאינו מפעיל אירועי הפעלה נוספים.
הערה: זמן הרכישה הכולל תלוי ברמת הביטוי וביעילות של ההשלמה.
טבלה 1. פריימרים לשיבוט ליניארי של פלסמידים המכילים שברי PAmCherry1. פלסמידים משובטים המכילים RN ו-RC יכולים להיות ליניאריים עם PCR הופכי בנקודת ההחדרה ב-N או ב-C של השברים. הרצפים רשומים 5' עד 3'.
| רצף פריימר (5' עד 3') |
| פלסמיד שיבוט להחדרה ב- N-terminus הפוך | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN ב- N-terminus forward | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC ב- N-terminus קדימה | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| פלסמיד שיבוט להחדרה ב- C-terminus קדימה | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN מ-C-terminus הפוך | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC מ- C-terminus הפוך | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
טבלה 2. תליה עבור פריימרים של גנים בעלי עניין התואמים לפריימרים של טבלה 1.
15 זוגות הבסיסים של הומולוגיה עבור התגובה הבלתי תלויה בקשירה נוצרים מתלישות פריימר. בנוסף, השלוחות כוללות את הרצף עבור מקשר גמיש (GGGGS)x2. במקום זאת, ניתן להוסיף את רצף המקשר הגמיש לפריימרים בטבלה 1. הרצפים רשומים 5' עד 3'.
| תליה עבור גן הפריימרים המעניינים (5' עד 3') |
| N-terminal insertion RN או RC forward | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminal החדרת RN הפוך | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminal insertion RC reverse | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminal החדרת RN קדימה | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal החדרת RC קדימה | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal החדרה RN או RC הפוך | GCGCCCACCCTTTTA |