$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תיוג של SBDS-FlAsH עם צבע פלואורסצנטי FlAsH 4',5'-Bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) פלואורסצאין
- ערבבו 3 nmol של חלבון SBDS-FlAsH (התג FlAsH מתאים למוטיב הטטרציסטאין Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys שהונדס גנטית במסוף C של חלבון SBDS רקומביננטי) עם 3 nmol של צבע פלואורסצאין 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) בנפח 5 μl של חיץ אנאיזוטרופי (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% גליצרול, 5 מילימטר β-מרקפטואתנול).
- תן לתגובה להמשיך במשך 8 שעות ב 4 ° C. Dialyze הדגימה כנגד חיץ Anisotropy במשך הלילה כדי להסיר את הצבע החופשי.
- השתמש בחוק למברט-באר כדי לכמת את אחוז החלבון המסומן. מדוד את הספיגה ב- 280 ננומטר ו- 508 ננומטר בספקטרופוטומטר באמצעות קובטת קוורץ בעלת נפח מתאים. הערה: שקול את מקדמי הבליעה המולריים הבאים (M-1 cm-1):
משוואה 1
- חשב את הריכוז של חלבון SBDS-FlAsH המסומן באמצעות משוואה 2.
משוואה 2
- חשב את הריכוז הכולל של חלבון SBDS באמצעות משוואה 3 על-ידי החלפת C SBDS-FlAsH המחושב מהשלב הקודם.
משוואה 3
- חישוב אחוז החלבון המסומן באמצעות משוואה 4.
משוואה 4
2. ניסויי אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית
הערה: ניסויי אנאיזוטרופיה נעשו בספקטרופלואורומטר המצויד בארגז כלים לקיטוב ואיסוף הנתונים בוצע באמצעות תוכנת האנאיזוטרופיה שסופקה בתוכנת הציוד. אורך גל העירור נקבע על 494 ננומטר עם רוחב פס ספקטרלי של 8 ננומטר והפליטה נרשמה באמצעות מסנן פס של 530±25 ננומטר. המדידות נעשו ב 25 ° C בקובט 200 μl עם אורך נתיב 5 מ"מ.
- בקובט פלואורסצנטי, מניחים 200 μl של 30 nM SBDS-FlAsH במאגר אנאיזוטרופי וטיטראט 2 μl של 30 μM EFL1. מערבבים היטב ונותנים לתגובה לעמוד במשך 3 דקות לפני מדידת ערך האנאיזוטרופיה.
- חזור על שלב 2.1 עד להוספת נפח כולל של 40 μl של EFL1.
3. ניתוח נתונים
- התאם את הנתונים למודל הקישור המתאים באמצעות אלגוריתם רגרסיה לא ליניארי של ריבועים פחותים. משוואות עבור מודלי הקישור הנפוצים ביותר מוצגות בטבלה 1.
- הערך את המודל הטוב ביותר המתאר את האינטראקציה בין החלבונים על ידי בדיקת שאריות ההתאמה. תמיכה במודל הנבחר עם ניסויים נוספים.
טבלה 1. מודלים נפוצים של קשירת אינטראקציה בין חלבונים לחלבונים והמשוואות המתמטיות המתארות אותם.
