בדיקת Electrophoretic Mobility Shift לזיהוי קומפלקסים של פקטור שעתוק-DNA

תקציר

מקור: Hsieh, Y. W. et al., פרוטוקול ממוטב לבדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית באמצעות אוליגונוקלאוטידים בצבע פלואורסצנטי אינפרא אדום. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית כדי לזהות אינטראקציות חלבון-דנ"א באמצעות בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית אינפרא אדומה. כאשר החלבון נקשר לבדיקת הדנ"א, הוא יוצר קומפלקס גדול הנודד באיטיות ומופיע כרצועה מוסטת על הג'ל.

פרוטוקול

1. תגובת קישור ואלקטרופורזה

1. הכן 1 מ"ל של חיץ מחייב 5x על ידי ערבוב 50 μL של 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 μL של 5 M NaCl; 200 μL של 1 M KCl, 5 μL של 1 M MgCl₂, 10 μL של 0.5 M EDTA, pH 8.0; 5 μL של 1 M DTT; 25 μL של 10 מ"ג/מ"ל BSA, ו 695 μL של ddH₂O.
   הערה: ניתן לאזן את מאגר הכריכה 5x ולאחסן אותו ב -20 °C. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון היא שלגורמי תמלול שונים יהיו שינויים שונים במאגר הקשירה.
2. ממש לפני הגדרת תגובות קשירה, הפעל מראש את ג'ל הפוליאקרילאמיד 5% המקורי ב- 0.5x TBE + 2.5% גליצרול כדי להסיר את כל עקבות האמוניום פרסולפט ב- 80 V למשך 30 - 60 דקות, או עד שהזרם כבר לא משתנה עם הזמן.
3. הגדר את תגובת הקישור בנפח הסופי של 20 μL.
   1. יש לערבב 4 μL של 5x חוצץ קושר, 80 - 200 ng חלבון מטוהר A (ב 50% גליצרול, כלומר, SOX-2), 1 μL של 0.1 מיקרומטר בדיקה מצומדת בצבע (ריכוז סופי: 5 nM), ו ddH₂O.
   2. אופציונלי: כאשר נדרשים מתחרים של בדיקות קרות, הוסף ריכוזים שונים (2x, 10x, 25x, 50x, 100x וכו ') של בדיקות קרות.
   3. אופציונלי: כאשר נבדקת האינטראקציה בין חלבונים A ו-B (כלומר, SOX-2 ו-LIM-4), יש להוסיף 80-200 ננוגרם חלבון B מטוהר (ב-50% גליצרול, כלומר LIM-4).
   4. אופציונלי: כאשר משתמשים בהכנת תמצית גרעינית ויש לאמת את הקישור הספציפי של חלבון A, יש להוסיף נוגדן ספציפי לחלבון A (כלומר, anti-6xHis, anti-FLAG וכו').
   5. דוגרים ב-R/T בחושך במשך 15 דקות.
4. יש להעמיס את כל תגובות הקישור על הג'ל ולהפעיל את הג'ל במהירות של 10 וולט/ס"מ למרחק הרצוי.

2. הדמיה

הערה: הג'ל נסרק ישירות בלוחות הזכוכית באמצעות מערכת הדמיה אינפרא אדומה מתקדמת. לכן, ניתן לפתור את הג'ל עוד יותר ולסרוק אותו שוב ושוב (איורים 1C ו-2 ). מערכת הדמיה פלואורסצנטית כמעט אינפרא אדומה בעיקר עבור כתמים מערביים נבדקה גם היא כדי לסרוק את הג'ל, אך רק מערכת הדמיה אינפרא אדומה מתקדמת הצליחה לסרוק את הג'ל ברזולוציה טובה. המתודולוגיה המתוארת היא ספציפית לתוכנת הדמיה אינפרא אדום מסוימת, אם כי ניתן להשתמש בחבילות תוכנה אחרות.

1. נקה את מיטת הסורק עם ddH₂O וייבש היטב לפני הסריקה. נגבו את לוחות הזכוכית של הג'ל והניחו את הצלחות המכילות את הג'ל על מיטת הסורק.
2. פתח את תוכנת הדימות אינפרא אדום ועבור לכרטיסייה 'רכישה'. כאשר הלוח הדק יותר (1 מ"מ) מונח על מיטת הסורק, השתמש בהגדרות של ערוץ: 700, עוצמה: אוטומטי, רזולוציה: 169 מיקרומטר, איכות: בינונית והיסט מיקוד: 1.5 מ"מ. כאשר הצלחת העבה יותר (3 מ"מ) מונחת על מיטת הסורק, השתמש בהגדרות של ערוץ: 700, עוצמה: אוטומטי, רזולוציה: 84 מיקרומטר, איכות: בינונית והיסט מיקוד: 3.5 מ"מ. הסטת המיקוד תלויה בעובי לוח הזכוכית.
3. בחר את האזור שהג'ל תופס בסורק. לחץ על 'התחל' כדי להתחיל בסריקה.

תוצאות

איור 1. fEMSA באמצעות אוליגונוקלאוטידים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי אינפרא אדום. (A) תרשים זרימה של fEMSA. (B) ההשפעה של צבע כחול ברומופנול, כתום G ו-dI-dC (1 מיקרוגרם) על fEMSA. נעשה שימוש ב-5 ננומטר של בדיקה 5'Dye-LIM-4/SOX-2. (C)fEMSA המציג ספציפיות קשירה של 6xHis-SOX-2^G73E לאתר היעד SOX-2 של אלמנט LIM-4/SOX-2. נעשה שימוש ב-5 ננומטר של בדיקה 5'Dye-LIM-4/SOX-2. LIM-4/SOX-...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
30% תמיסת אקרילאמיד/ביס, 37.5:1	ביו-ראד	1610158	אקרילאמיד מזיק ורעיל.
סרום בקר אלבומין ברמה ביולוגית מולקולרית	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	טכנולוגיות DNA משולבות	אוליגו DNA מותאם אישית	אלה מכונים בכתב היד אוליגוס DNA פלואורסצנטי 5'Dye או אינפרא אדום המסומנים בצבע פלואורסצנטי. החברה תסנתז בהתאמה אישית אוליגונוקלאוטידים של DNA 5' IRDye. דורש סינתזה בקנה מידה מינימלי של 100μM וטיהור HPLC.
תא אלקטרופורזה אנכי Mini-PROTEAN	ביו-ראד	1658000FC	מכשיר
מערכת הדמיה אינפרא אדומה Odyssey CLx	LI-COR ביוטכנולוגיה	מערכת Imagng אינפרא אדום Odyssey CLx	מכשיר
מערכת הדמיה Odyssey Fc	LI-COR ביוטכנולוגיה	מערכת הדמיה דו-מצבית Odyssey Fc	מכשיר
תוכנת Image Studio (גרסה 4.0)	LI-COR ביוטכנולוגיה	תוכנת Image Studio	תוכנה
כתום G	סיגמא-אולדריץ'	O3756-25G	כימי
6x צבע טעינה כתום			0.25% כתום גרם; 30% גליצרול
0.5x TBE			45 מ"מ טריס-בוראט; 1 מ"מ EDTA
1x TE			10 מ"מ Tris-HCl; 1 מ"מ EDTA, pH8.0
1x STE			100 מ"מ NaCl; 10 מ"מ Tris-HCl, pH8.0; 1 מ"מ EDTA
5x מאגר מחייב			50 מ"מ Tris-HCl, pH7.5; 50 מ"מ NaCl; 200 מ"מ KCl; 5 מ"מ MgCl2; 5 מ"מ EDTA, pH8.0; 5 מ"מ DTT; 250 מ"ג/מ"ל BSA