כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. טיהור תאי שושלת אוליגודנדרוציטים חיוביים PDGFRα ממוח העכבר (שונה מפרוטוקולי אימונופנינג שתוארו קודם לכן)
- הכנת פלטת אימונופנינג לבחירת תאים חיוביים PDGFRα ו-2 צלחות לדלדול תאי אנדותל ומיקרוגליה.
הערה: שימו לב שצלחות פטרי אך לא צלחות תרבית תאים עובדות לניסוי אימונופנינג; אם התאים המטוהרים ישמשו לתרבית, יש לבצע שלבי אימונופנינג בארון הבטיחות הביולוגית
- מצפים צלחת פטרי 10 ס"מ עם 30 μL עז נגד חולדות IgG ב 10 מ"ל של pH 9.5, 50 mM Tris-HCl לילה ב 4 ° C. להסעיר את הצלחת כדי לוודא את פני השטח של הלוחות מכוסים באופן שווה ומלא על ידי תמיסת הציפוי.
- הכן תמיסת נוגדנים PDGFRα על ידי דילול 40 μL של נוגדן נגד PDGFRα של חולדה עם 12 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) המכיל 0.2% BSA.
- לאחר 3 שטיפות של צלחת מצופה IgG עם 10 מ"ל 1x DPBS כל אחד, לדגור צלחת מצופה IgG עם תמיסת נוגדנים PDGFRα בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
- שטפו את הצלחת המצופה נוגדנים נגד PDGFRα 3 פעמים עם 10 מ"ל 1x DPBS כל אחד. הוסיפו בעדינות תמיסת DPBS לאורך הדופן הצדדית של הצלחת ואל תפריעו למשטחים המצופים.
- ציפוי 2 לוחות פטרי חדשים בקוטר 15 ס"מ לדלדול תאי אנדותל ומיקרוגליה ב-20 מ"ל DPBS המכילים 2.3 מיקרוגרם/מ"ל של Banderiaea simplicifolia lectin 1 (BSL-1) למשך שעתיים.
- שטפו את הצלחות מצופות BSL-1 3 פעמים עם 20 מ"ל 1x DPBS. הוסיפו בעדינות תמיסת DPBS לאורך הדופן הצדדית של הלוחות ואל תפריעו למשטחים המצופים.
- טיהור תאי שושלת אוליגודנדרוציטים חיוביים PDGFRα שונה משיטות שפורסמו בעבר.
- נתחו את רקמות קליפת המוח ממוחות של עכברים ביום 7 (P7) לאחר הלידה על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר.
- נתק את הרקמות כדי ליצור תרחיף חד-תאי עם ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות (P) בהתאם להוראות היצרן המפורטות.
- בקצרה, לחתוך את רקמות קליפת המוח מנותחות לחתיכות עם אזמל ונושא אותם לעיכול אנזימטי ב 37 ° C. לאחר העיכול, לנתק ידנית את החתיכות עם פיפטות פסטר זכוכית מלוטשת אש לתוך תרחיף חד תא.
- צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב-300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והשהה את כדורית התא באמצעות 15 מ"ל של חיץ אימונופנינג (חיץ אימונופנינג הוא DPBS עם 0.02% BSA ו-5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין).
- יש לדגור על התרחיף החד-תאי ממוחות של 2 עכברים ברצף על 2 לוחות מצופים BSL-1 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה של הצלחת כל 5 דקות כדי להבטיח דלדול טוב יותר של תאי מיקרוגליה ואנדותל.
- מערבלים בעדינות את הצלחת כדי לאסוף את התאים שאינם נדבקים בתרחיף התא ולדגור עליהם על הצלחת המצופה נוגדנים PDGFRα של חולדה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה של תרחיף התא על הצלחת המצופה נוגדנים PDGFRα, סובבו בעדינות את הצלחת כדי לאסוף את תרחיף התא, ושטפו את הצלחת 8 פעמים עם DPBS כדי להיפטר מתאים שאינם דבקים. מוסיפים בעדינות תמיסת שטיפה לאורך הדופן הצדדית של הצלחת ומסעירים את הצלחת מספר פעמים כדי להיפטר מתאים שאינם נדבקים.
- נתקו את התאים מהצלחת המצופה בנוגדן חולדה-PDGFRα באמצעות טיפול של 4 מ"ל בתמיסת ניתוק תאים למשך 10 דקות ב-37°C. נערו את הצלחת כדי לעקור תאים דבקים.
- לאסוף את OPC מטוהרים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר, להשעות את גלולת התא עם 2 מ"ל OPC תרבית התא בינוני, ולספור את התאים באמצעות כחול טריפאן hemocytometer (500 מ"ל תרבית תאים בינוני ב DMEM/F12 בינוני המכיל 5 מ"ל תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (P / S), 5 מ"ל N2, 10 מ"ל B27, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 0.1% BSA, 20 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 נ"ג/מ"ל PDGFRα).
- אימות טוהר OPCs לאחר immunopanning.
- על מנת להעריך את העשרת OPC לאחר אימונופנינג יש להשתמש בחלק מה-OPC המטוהרים למיצוי RNA באמצעות מיצוי מבוסס גואנידיום תיוציאנט בהתאם להוראות היצרן.
- בצע qRT-PCR באמצעות תערובת מאסטר צבע ירוק פלואורסצנטי כדי לבדוק את העשרת ביטוי PDGFRα ב- OPC מטוהרים בהשוואה לתאי מוח מנותקים על פי החומרים שפורסמו בעבר.
- בנוסף, זרעו כמה OPCs מטוהרים לתוך Poly-D-Lysine מצופה 24 צלחות באר עבור immunostaining עם נוגדן אנטי NG2 chondroitin sulfate proteoglycan (NG2) כפי שפורסם בעבר חומרים.
2. הכנת ChIP של תאים נמוכים ובניית ספריית ChIP לריצוף בתפוקה גבוהה
- הכנת Olig2 Low-cell ChIP עם מערכת סוניקציה זמינה מסחרית וערכת ChIP בעלת מספר תא נמוך הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) על ידי ביצוע הנהלים הסטנדרטיים המפורטים מהוראות היצרן.
- לאחר התנתקות מהלוחית המצופה נוגדנים נגד PDGFRα בחולדה וספירת התאים עם טריפאן כחול והמוציטומטר, הכניסו 20,000 OPC מטוהרים במדיום תרבית תאי OPC של 1 מ"ל עבור כל תגובת ChIP.
- הוסף 27 μL של 36.5% פורמלדהיד כדי לתקן את תרחיף התא למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
זהירות: אנא שימו לב כי יש להשתמש בפורמלדהיד במכסה האדים הכימי מטעמי בטיחות.
- עצור את הקישור הצולב-חלבוני DNA עם גליצין 50 μL 2.5M למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: כל השלבים חייבים להתבצע על קרח או בחדר קר 4 מעלות צלזיוס מנקודה זו.
- שטפו את כדורי התא הצולבים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) קרה כקרח עם קוקטייל מעכב פרוטאז וקבלו תאים שנפלטים על ידי צנטריפוגה מקוררת מראש ב 300 x גרם ב 4 ° C.
- ליזוז את גלולת התא ב 25 μL חיץ ליזיס שלם במשך 5 דקות על קרח.
הערה: הסעיר את הצינור כדי להשעות את התאים במאגר ליזיס.
- השלימו את התא ליזט עם HBSS קר כקרח 75 μL המכיל קוקטייל מעכבי פרוטאז וגזירת הכרומטין של התא ליזט על ידי מערכת סוניקציה מקוררת מראש עם 5 מחזורים של תוכנית 30 s ON ו- 30 s OFF. חברו תמיד 6 צינורות יחד וודאו שצינורות האיזון מכילים 100 מיקרוליטר מים.
- לאחר הגזירה, צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף supernatant בצינור חדש לאחר צנטריפוגה.
- לדלל 100 μL של כרומטין גזוז עם נפח שווה של חיץ ChIP שלם קר כקרח עם מעכב פרוטאז.
- שמור 20 μL של הכרומטין המדולל כדגימת בקרת קלט.
הערה: דגימת בקרת קלט נדרשת גם כהשוואה לדגימה החיסונית של Olig2 כדי לזהות DNA חיסוני של נוגדן Olig2.
- הוסף 1 μL של נוגדן ארנב anti-olig2 ל 180 μL של הכרומטין המדולל גזוז ודגר את צינור התגובה על גלגל מסתובב ב 40 סל"ד במשך 16 שעות ב 4 ° C.
הערה: בצע שלב זה בחדר קר.
- עבור כל תגובת ChIP, יש לשטוף 11 μL חלבון מגנטי חרוזים מצופים A עם 55 μL מאגר שטיפת חרוזים ולשים את גלולת החרוזים ב 11 μL של חיץ שטיפת חרוזים לאחר 2 כביסות.
הערה: בצע שלב זה בחדר קר.
- עבור כל תגובת ChIP, הוסף 10 μL של חרוזים מצופים חלבון A שטופים מראש לצינור התגובה ChIP. בצע שלב זה בחדר קר.
- לדגור על צינור התגובה ChIP ב 4 ° C במשך 2 שעות נוספות על גלגל מסתובב.
- הנח את צינור התגובה ChIP על המדף המגנטי למשך דקה < / >
הערה: בצע שלב זה בחדר קר.
- מוציאים את הסופרנאטנט ולא עוקרים את גלולת החרוזים.
- שטפו את גלולת החרוזים עם 100 μL עבור כל אחד מארבעת מאגרי הכביסה בהתאמה למשך 4 דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורה של 4°C.
- לאחר השטיפה, הוסף 200 μL של חיץ elution לגלולת החרוזים ודגר על צינור התגובה ChIP ב 65 ° C במשך 4 שעות כדי להפוך את קישור חלבון-DNA.
- בנוסף, הוסף 180 μL של חיץ elution לדגימת בקרת קלט של 20 μL ודגור ב- 65 ° C למשך 4 שעות כדי להפוך גם את ה- DNA של חלבון-קישור צולב.
- הוסף 200 μL 25:24:1 (v/v) תערובת של פנול, כלורופורם ואלכוהול איזואמיל לכל צינור תגובת ChIP.
- מערבולת במרץ במשך דקה אחת וצנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את השלב העליון לצינור חדש.
- הוסף 40 μL 3 M תמיסת נתרן אצטט, 1,000 μL של 100% אתנול, ו 2 μL של משקע גליקוגן מקושר קוולנטית לצבע כחול לכל צינור תגובת ChIP למשך הלילה ב -20 ° C.
- צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- יש להשליך את הסופרנטנט, לשטוף עם אתנול קר 70% בנפח 500 ליטר ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 13,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C.
- יש להשליך את הסופרנטנט, לשמור על אוויר הגלולה יבש למשך 10 דקות, ולהמיס את הגלולה עם 50 מיקרוליטר מים.
- בניית ספריית ChIP לריצוף בתפוקה גבוהה
- נקו וריכזו את ה-DNA של ChIP בעזרת ערכת ניקוי בהתאם להוראות היצרן.
- כמת את דגימת ChIP עם פיקו-ירוק בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש בערכת ChIP-seq עבור T-tailing, שכפול וזנב, מיתוג והרחבה של תבניות, הוספת מתאמים והגברה, בחירת גודל ספרייה וטיהור בהתאם להוראות היצרן.
- לאחר דנטורציה של dsDNA, dephosphorylate את קצה 3' של ssDNA על ידי phosphatase אלקליין שרימפס ולהוסיף זנב פולי (T) ל- ssDNA על ידי deoxynucleotidyl transferase טרמינלי.
- אנאל את פריימר DNA Poly (dA) לתבנית ssDNA עבור שכפול DNA והחלפת תבניות.
- לאחר החלפת תבניות, הגבר את ספריית ChIP-seq על ידי PCR עם פריימרים קדימה ואחורה ליצירת אינדקס.
- בחר את ספריית ChIP-seq מוגברת PCR עם מקטעים הנעים בין 250 ל 500 bp על ידי חרוזים פאראמגנטיים על ידי אפשרות 2 לבחירת גודל כפול.
- בדוק את איכות ספריית ChIP-seq שנבחרה באמצעות מכשיר אלקטרופורזה שבב-נימי מיקרופלואידי.
