1. מיקרוסקופ קיטוב
- לתאורת לייזר בשדה רחב, מקד קו 638 ננומטר של לייזר דיודה רציף (40 mW) בצמצם של סיב אופטי מרובה מצבים לניקוי אלומה. הרכיבו מקטב ליניארי בפלט הסיב כדי לקבוע את הקיטוב של אור הלייזר.
- חסום את רכיב העירור של האור הנפלט באמצעות מראה דיכרואית (חיתוך של 640 ננומטר) ומסנן פסים (bandpass 700/75).
- תן לאות הפלואורסצנטי לעבור דרך מפצל קרן מקטב, אשר מפצל את האור הנפלט למרכיביו המקוטבים הניצבים והמקבילים. לאחר מכן, מקדו את הקרן שאינה משתקפת (רכיב מקבילי) ואת הקרן המוחזרת (רכיב מאונך) עם עדשה אכרומטית באורך מוקד של 200 מ"מ על שבב של מצלמת EM-CCD עם תאורה אחורית (איור 1b ו-1c). השתמש במראה כדי להתאים את כיוון הקרן הניצבת לכיוון העדשה.
2. תכנון ובדיקה של אוליגומר DNA ייחוס עם תווית פלואורסצנטית
- קביעת רצף הליבה של דנ"א הייחוס: השיטה מבוססת על בדיקה תחרותית המודדת את קבוע הדיסוציאציה (KD2) בין גורם שעתוק לבין אוליגומר DNA מתחרה ללא תווית המתחרה על קשירה עם DNA המסומן באופן פלואורסצנטי וזיקתו ל- TF פועלת כנקודת ייחוס (KD1). רצף הקונצנזוס המתקבל ממקורות אחרים כמו טביעת רגל DNase או חיידקי 1-היברידי יכול לשמש כנקודת התחלה.
הערה: ככלל אצבע, לדנ"א ייחוס מתאים יש ירידה של פי 3 עד פי 7 בזיקה ל-TF בהשוואה לרצף הקונצנזוס.
- מדידה על ידי HiP-FA את KD1s של 2-3 מוטציות בודדות טנטטיביות של רצף הקונצנזוס שנגזר בשלב הקודם. נסה לשנות עמדות ברצפי קונצנזוס שאינם ספציפיים מדי כדי למנוע אובדן מוחלט של הקשירה.
הערה: חשוב שרצף הייחוס יהיה כבול לגורם התעתיק המעניין (השתמשנו בפרוטוקול זה Giant Gt), אך לא חזק מדי, כך שמתחרים חלשים יותר יוכלו להתחרות בו בריכוזים גבוהים.
- הרחב את מוטיב הליבה (8-12 זוגות בסיסים בדרך כלל) לאורך של 16 זוגות בסיסים או יותר על ידי הוספת רצף איגוף סימטרי משני הצדדים (הוסף שרשראות צד לקשירה נכונה). במידת הצורך (עבור תחומי קישור ארוכים יותר, לדוגמה), השתמש ברצפים ארוכים יותר (עד ~50 זוגות בסיסים באורך נבדקו עם מבחן HiP-FA).
זהירות: היזהר שלא להוסיף בסיסים שצפויים ליצור אתרי קשירה חוץ רחמית. השתמש בכלים חישוביים המנבאים אתרי קשירה מ- PWM זמינים כדי להקל על תהליך זה (לדוגמה, PySite).
- כדנ"א ייחוס מסומן, סדרו אוליגומרים המסומנים באופן פלואורסצנטי על גדיל קדמי או הפוך בקצה 3' או 5'. השתמשו, למשל, Cy5, Bodipy-650, או כל צבע מתאים אחר בריכוז של 10 מיקרומטר (100 מיקרומטר 10x מלאי) במים, ודללו בהדרגה כמתואר בשלב 3.1.
- הכן 500 מ"ל של חיץ קשירה 1x על ידי הוספת מאגר אשלגן פוספט 33 mM (pH = 7.0), 90 mM NaCl, ו 0.01% דטרגנט לא יוני במים מזוקקים. הכינו גם חיץ מחייב 3x, המכיל את אותם רכיבים, למעט בריכוזים משולשים. אם אתה משתמש במאגר קשירה 3x כפתרון מלאי עבור מאגר הכריכה 1x, הכן אמצעי אחסון > 500 מ"ל; אחרת, להכין 250 מ"ל
הערה: הרכב זה הותאם ליציבות גורמי שעתוק ולמניעת דימריזציה של גלוטתיון S-transferase (GST).
- מדוד באמצעות מערך המיקרוסקופ המתואר בשלב 1 את FA של 200 μL של מאגר קישור המכיל 0.8 ננומטר מסומן DNA ייחוס בנוכחות כמויות שונות של TF במיקרוסקופ תחתית זכוכית צלחת 96 בארות (5-6 בארות עם ריכוזי TF שונים) כדי לקבוע את ריכוז TF לשימוש. בצע סדרת טיטרציה עם כמויות הולכות וגדלות של TF ובחר עבור הבדיקה את הריכוז שעבורו העקומה מגיעה לרמה, המציין קשירה מלאה של אוליגומר הייחוס DNA.
הערה: ריכוז TF אופטימלי תלוי בערכים של קבועי הדיסוציאציה TF-DNA. בדרך כלל, KDנמוך דורש ריכוזים נמוכים יותר.
3. אוליגומר אנלינג
- כדי לשלול את אוליגומרים הדנ"א של דנ"א הייחוס המסומן (רצף שנקבע בשלב הקודם), ערבבו 7 μL של תמיסת DNA חד-גדילית קדמית מסומנת בצבע 10 mM ו-7 μL של ריכוז 10 mM של המשלים ההפוך הבלתי מסומן שלה ב-186 μL מים.
- עבור רצפי הדנ"א המתחרים, ערבבו 20 μL של תמיסות 100 mM (במים, שסופקו על ידי היצרן) של DNA חד-גדילי קדמי עם 20 μL של 100 mM של ה- DNA החד-גדילי ההפוך המתאים לכל רצף מתחרה בודד שיש למדוד.
- בצע את החישול בנפרד במחזור PCR סטנדרטי על ידי חימום התמיסות ל- 70 ° C למשך 3 דקות והורדת הטמפרטורה ל- RT בקצב של 0.1 K/s. אם מכשיר ה-PCR המשמש אינו תומך בשיפועי טמפרטורה בקצב זה, פשוט בצע דגירות הדרגתיות עם טמפרטורות יורדות (נבדקו 99 מחזורים של 3 שניות עם -0.4 K למחזור).
4. הכנת ג'ל
הערה: החלק הבא מסביר את ההכנה של שני סוגים שונים של ג'לים: 1) בארות הטיטרציה מכילות ג'לים עם חלבון ומשמשות לקביעת KDs עבור רצפי הדנ"א המתחרים בהתאמה, 2) בארות הכיול משתמשות ב-NB כדי לקבוע את ריכוז הדנ"א בכל נקודת זמן נתונה ואת גובה הרכישה. ההתמקדות היא בהכנת הניסוי בצלחת של 96 בארות, אך מצוין גם הכרכים המתאימים לפורמט צלחת של 384 בארות.
- יש להמיס 0.5% עם נקודת התכה נמוכה במאגר הקשירה על ידי הרתחתו במיקרוגל מעבדה. לאחר פירוק מלא, כוונן שוב את עוצמת הקול עם ddH2O כדי לפצות על אידוי אפשרי.
הערה: לנוחותכם, הכינו מלאי של 10-20 10 מ"ל של הג'לים והמיסו אותם בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס בעת הצורך. ניתן לאחסן מניות ג'ל בכתובת RT.
זהירות: היזהרו להימנע מחימום יתר של תמיסת הג'ל במיקרוגל. עדיף מרווחי זמן חימום קצרים עם רעידות ביניהם.
- כדי להכין בארות טיטרציה וכיול, תחילה להמיס שני aliquots מלאי ג'ל 10 מ"ל ב 75 ° C תחת רעידה.
- השתמש ב- 240 μL (כולל תקורה של 20%) עבור כל מתחרה (n = מספר רצפי המתחרים).
- השתמש באותו נפח של ג'ל עבור כיול NB היטב כדי להבטיח טמפרטורה שווה צמיגות של שני הג'לים.
- לאחר מכן הגדר את הטמפרטורה ל 35 °C (75 °F) והמתן עד שהטמפרטורה תתאזן.
- עבור בארות הטיטרציה, הוסף 1.4 ננומטר (ריכוז סופי) DNA ייחוס היברידי (המתקבל בשלב 3), חלבון TF (ריכוז סופי CTF = 20-60 ננומטר, כפי שנקבע בשלב 2.6), DTT (0.2 מילימטר), ומאגר קשירה בנפח כולל של n x 200 μL או n x 13 μL בפורמט צלחת 96 או 384 בארות, בהתאמה (בתוספת תקורה). מערבבים היטב על ידי היפוך/ניעור (אין מערבולת).
- הוסף באיטיות 200 μL לבאר בפורמט צלחת 96 בארות (13 μL / באר עבור 386 בארות) של תמיסת הג'ל שהוכנה בשלב הקודם לתוך בארות הטיטרציה של צלחת הבאר.
- עבור בארות כיול, ראשית, להוסיף 5 ננומטר NB לג'ל המומס מחוץ לבארות (נפח כולל בהתאם לפורמט צלחת באר בשימוש ועל מספר בארות כיול; בדרך כלל 5-6 לכל צלחת באר מספיק).
- פיפטה 200 μL (13 μL עבור פורמט צלחת 384 בארות) של ג'ל המכיל NB לאט בתוך בארות הטיטרציה של צלחת הבאר ולוודא למנוע בועות אוויר.
הערה: השימוש בפיפטים אלקטרוניים או רובוטיקה מגדיל באופן משמעותי את יכולת השחזור.
- תנו לג'ל להתמצק למשך 10 דקות ב-RT, ועוד 10 דקות ב-4°C (הסירו את העיבוי מהזכוכית לאחר מכן במידת הצורך). הקפד לבצע את כל השלבים הללו על משטח אופקי לחלוטין כדי למנוע משטחי ג'ל לא הומוגניים.
הערה: החלבונים המכילים ג'לים יציבים בדרך כלל לפחות למספר שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
5. הוספת פתרון DNA מתחרה
הערה: יש להכין את הפתרונות הבאים לפני תחילת הטיטרציה והם מתווספים על גבי בארות הכיול והטיטרציה בו זמנית.
- הוסף את DNA הייחוס המסומן בחיץ קישור 3x בריכוזים גבוהים פי 3 מאשר aliquots מלאי ג'ל.
- ערבבו 20 μL של התמיסה המתקבלת עם 40 μL של כל תמיסת DNA מתחרה מחושלת המתקבלת בשלב 3.
- עבור כל כיול היטב, ערבבו 20 μL של חיץ קשירה 3x המכיל תמיסת NB של 15 mM עם 40 μL של DNA מתחרה מחושל (כל רצף באותו אורך מתאים).
הערה: עבור לוחות 384 בארות, השתמש 21 μL במקום 60 μL בסך הכל.
- לחלופין, בדוק את ההומוגניות של רמות גובה הג'ל בבארות השונות של הצלחת באופן ספקטרוסקופי על ידי מדידת הספיגה ב 380 ננומטר, באמצעות קורא לוחות רב בארות (ערכי הספיגה פרופורציונליים לגבהים הג'ל).
- הוסף 50 μL (7 μL עבור פורמט צלחת 384 באר) של תמיסות DNA מתחרה מעורב (מחושל בשלב 3) על גבי הג'לים. נסו להוסיף את כל הפתרונות המתחרים בו זמנית ככל האפשר באמצעות פיפטות אלקטרוניות רב ערוציות או ראש פיפטינג 96 ערוצים, אם קיים. לאחר הוספת הפתרונות המתחרים, הניחו את הצלחת על במת המיקרוסקופ והתחילו מיד במדידות.
6. רכישת תמונות
- קבל סדרות זמן ברצף של ערימות z (למשל, השתמש ב-12 מישורים ו-100-300 מילישניות של זמן תאורה). הימנע מצילום תמונות קרוב מדי לפני השטח של הבאר (< ~ 1.4 מיקרומטר עם הלוחות המשמשים כאן) כדי למנוע הטיית קיטוב.
- בצע 10-25 מחזורים של מדידות עד לביטול מוחלט של DNA הייחוס המסומן מה- TF. נקודת הסיום מגיעה בדרך כלל לאחר 1-2 שעות, בהתאם לקינטיקה הקושרת והדיפוזיביות של הדנ"א המתחרה.
