1. הכנת המערכת
- תכנון פלסמידים באתר קשירה
- עצבו את קלטת אתר הכריכה כפי שהיא מתוארת באיור 1. כל מיניגן מכיל את החלקים הבאים (5' עד 3'): אתר הגבלת Eagl, ∼40 בסיסים של קצה 5' של גן העמידות לקנמיצין (Kan), מקדם pLac-Ara, אתר קישור ריבוזום (RBS), AUG של הגן mCherry, ספייסר (δ), אתר קישור RBP, 80 בסיסים של קצה 5' של הגן mCherry, ואתר הגבלת ApaLI.
הערה: כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הבדיקה, תכנן שלוש קלטות אתר קשירה לכל אתר קשירה, עם ספייסרים המורכבים לפחות מבסיס אחד, שניים ושלושה בסיסים. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת הנחיות נוספות.
- שיבוט פלסמידים באתר קשירה
- הזמינו את קלטות אתר הקישור כמיניגנים דו-גדיליים של DNA (dsDNA). אורכו של כל מיניגן הוא ∼500 bp והוא מכיל אתר הגבלת Eagl ואתר הגבלה ApaLI בקצוות 5' ו-3', בהתאמה (ראה שלב 1.1.1).
הערה: בניסוי זה, מיני-גנים עם מחצית מגן הקנמיצין הוזמנו כדי להקל על סינון מושבות חיוביות. עם זאת, הרכבת גיבסון מתאימה גם כאן, ובמקרה זה ניתן להזמין את אתר הקישור כשני אוליגוס DNA חד-גדילי משלימים קצרים יותר.
- לעכל פעמיים הן את המיני-גנים והן את וקטור המטרה עם Eagl-HF ו-ApaLI על ידי פרוטוקול ההגבלה, ולטהר עמודות.
- קשרו את המיניגנים המעוכלים לעמוד השדרה של אתר הקישור המכיל את שאר הגן mCherry reporter, שליחות קטלנית וגן עמידות לקנמיצין.
- הפוך את תמיסת הקשירה לתאי Escherichia coli TOP10.
- זיהוי טרנספורמטורים חיוביים באמצעות ריצוף סנגר.
- עצבו פריימר 100 בסיסים במעלה הזרם לאזור העניין (ראו טבלה 1 לרצפי פריימר).
- מינימום כמה מושבות חיידקים.
- הכינו 5 μL של תמיסת 5 mM של הפריימר ו-10 μL של הדנ"א בריכוז של 80 ng/μL.
- שלח את שני הפתרונות למתקן נוח לריצוף סנגר.
- אחסנו פלסמידים מטוהרים בטמפרטורה של -20°C, וזני חיידקים כמלאי גליצרול, שניהם בפורמט של 96 בארות. לאחר מכן DNA ישמש לטרנספורמציה לתאי E. coli TOP10 המכילים אחד מארבעה פלסמידים מסוג fusion-RBP (ראה שלב 1.3.5).
- תכנון ובנייה של פלסמיד RBP
הערה: רצפי חומצות אמינו ונוקלאוטידים של חלבוני הפרווה ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 2.
- סדרו את רצף ה-RBP הנדרש ללא קודון עצירה כמיניגן dsDNA בהזמנה אישית חסר קודון עצירה עם אתרי הגבלה בקצוות (איור 1).
- שכפל את ה-RBP הנבדק חסר קודון עצירה מיד במורד הזרם של מקדם השריה ובמעלה הזרם של חלבון פלואורסצנטי חסר קודון התחלה (איור 1), בדומה לשלבים 1.2.2-1.2.4. ודא כי פלסמיד RBP מכיל גן עמידות לאנטיביוטיקה שונה מאשר פלסמיד אתר הקשירה.
- זהה טרנספורמטורים חיוביים באמצעות ריצוף Sanger, בדומה לשלב 1.2.5 (ראה טבלה 1 עבור רצפי פריימר).
- בחר טרנספורמנט חיובי אחד והפוך אותו לבעל יכולת כימית. אחסנו כפלסמידים מטוהרים גליצרול בטמפרטורה של -20°C ומלאי גליצרול של זני חיידקים בטמפרטורה של -80°C בצלחות של 96 בארות.
- הפוך את הפלסמידים באתר הקישור (משלב 1.2.6) המאוחסנים בצלחות של 96 בארות לתאי חיידקים בעלי כשירות כימית שכבר מכילים פלסמיד RBP-mCerulean. כדי לחסוך זמן, במקום לצפות את התאים על צלחות פטרי, צלחת אותם באמצעות פיפטור 8 ערוצים על לוחות 8 נתיבים המכילים אגר לוריא-ברטאני (LB) עם אנטיביוטיקה רלוונטית (Kan ו Amp). מושבות צריכות להופיע תוך 16 שעות.
- בחרו מושבה אחת לכל טרנספורמנט כפול וגדלו לילה בתווך LB עם האנטיביוטיקה הרלוונטית (Kan ו-Amp) ואחסנו כמלאי גליצרול בטמפרטורה של -80°C בצלחות של 96 בארות.
2. מערך הניסוי
הערה: הפרוטוקול המוצג כאן בוצע באמצעות מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים בשילוב עם אינקובטור וקורא לוחות. כל מדידה בוצעה עבור 24 ריכוזי השראה, עם שתי כפילויות לכל זן + שילוב השראה. באמצעות מערכת רובוטית זו נאספו נתונים עבור 16 זנים ביום עם 24 ריכוזי זירוז. עם זאת, אם מכשיר כזה אינו זמין, או אם יש צורך בפחות ניסויים, ניתן לעשות זאת בקלות ידנית באמצעות פיפטה רב-ערוצית בת 8 ערוצים והתאמת הפרוטוקול בהתאם. לדוגמה, נתקבלו תוצאות ראשוניות עבור ארבעה זנים ביום עם 12 ריכוזי השראות וארבע נקודות זמן באופן זה.
- הכינו, מראש, 1 ליטר של חיץ bioassay (BA) על ידי ערבוב 0.5 גרם טריפטון, 0.3 מ"ל גליצרול, 5.8 גרם NaCl, 50 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 10x חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS) pH 7.4, ו 950 מ"ל של מים מזוקקים כפול (DDW). Autoclave או סטרילי מסנן את מאגר BA.
- לגדל את הזנים הטרנספורמנטים הכפולים ב-37°C וב-250 סל"ד תוך ניעור ב-1.5 מ"ל LB בעזרת אנטיביוטיקה מתאימה (קנמיצין בריכוז סופי של 25 מק"ג/מ"ל ואמפיצילין בריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל), בצלחות בנות 48 בארות, במשך תקופה של 18 שעות (למשך הלילה).
- בבוקר, בצע את ההכנות הבאות.
- צלחת השראה. בצלחת נקייה של 96 בארות, להכין בארות עם בינוני עני למחצה (SPM) המורכב של 95% BA ו 5% LB26 באינקובטור ב 37 °C (77 °F). מספר הבארות מתאים למספר הרצוי של ריכוזי השראות. הוסף C4-HSL לבארות בלוח השרייה שיכיל את ריכוז ההשראות הגבוה ביותר (218 ננומטר).
- תכנת את הרובוט לדלל באופן סדרתי תווך מכל אחת מהבארות בעלות הריכוז הגבוה ביותר ל-23 ריכוזים נמוכים יותר, הנעים בין 0 ל-218 ננומטר. הנפח של כל דילול משרה צריך להספיק לכל הזנים (כולל כפילויות).
- בזמן שהדילול המושרה מוכן, חם 180 מיקרוליטר של SPM באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, בצלחות 96 באר.
- לדלל את זני הלילה משלב 2.2 בפקטור של 100 על ידי דילולים סדרתיים: ראשית, לדלל פי 10 על ידי ערבוב 100 μL של חיידקים עם 900 μL של SPM בלוחות 48 באר, ולאחר מכן לדלל שוב בפקטור של 10 על ידי לקיחת 20 μL מהתמיסה המדוללת לתוך 180 μL של SPM שחומם מראש, בלוחות 96 בארות המתאימים למדידות פלורסנט.
- מוסיפים את ההשרייה המדוללת מצלחת ההשראות לצלחות 96 בארות עם הזנים המדוללים בהתאם לריכוזים הסופיים.
- נערו את הלוחות בעלי 96 הקידוחים בטמפרטורה של 37°C במשך 6 שעות, תוך ביצוע מדידות של צפיפות אופטית ב-595 ננומטר (OD595), mCherry (560 ננומטר/612 ננומטר) ופלואורסצנטיות mCerulean (460 ננומטר/510 ננומטר) באמצעות קורא לוחות כל 30 דקות. למטרות נורמליזציה, מדוד את הצמיחה של SMP ללא תוספת תאים.
