בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

תקציר

מקור: Tripathi, P. et al., A Modified Yeast-One Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

פרוטוקול

1. יום 9 (בוקר): התחל את התרבית למדידה אנזימטית.

1. השהה מחדש תרבית והעבר 125 μL באמצעות פיפטה רב ערוצית על לוח ספקטרופוטומטר (למדוד OD₆₀₀).
   הערה: אזהרה: אין לוותר על הטיפה האחרונה כדי למנוע בועות, אם OD₆₀₀ הוא מתחת 0.3 - 0.6, לדגור את התאים הנותרים במשך 1 - 2 שעות יותר על סמך הקריאה. תרבית 125 μL המשמשת בשלב זה ניתנת להשלכה או להעברה חזרה לבלוק הבאר העמוקה המקורי לפי שיקול דעתו של המשתמש.
2. צנטריפוגה את התאים הנותרים בבלוק הבאר העמוק למשך 10 דקות ב 3000 x גרם ו 21 ° C. להסיר supernatant על ידי היפוך.
3. הוסף 200 μL של Z-buffer ו- vortex.
   הערה: ראו את המתכון לחיץ Z בטבלה 1.
4. צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 3000 x גרם ו-21°C. יש להסיר את הסופרנאטנט על ידי היפוך.
5. הוסף 20 μL Z-buffer ומערבולת.
6. כסו את הצלחת ברדיד איטום שיכול לעמוד בפני מחזורי הקפאה-הפשרה. יש לבצע 4 מחזורים של הקפאה/הפשרה באמצעות חנקן נוזלי במנדף ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס באמבט מים (2 דקות כל אחד).
7. הוסף 200 μL Z-buffer/beta-mercaptoethanol (β-ME)/Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 מ"ל, 21 μL, 8.4 מ"ג בהתאמה יניב 20 מ"ל פתרון; תמיד להכין טרי).
   הערה: ל- ONPG ייקח קצת זמן להתמוסס כראוי ולכן הכינו את הפתרון שעה לפני ההגעה לשלב זה. ONPG משמש כמצע למדידת פעילות β-גלקטוזידאז.
8. יש לדגור עד 17-24 שעות ב-30°C (בדקו בין לבין, אם הצבע מתפתח מוקדם יותר, המשיכו לשלב הבא).

2. יום 10 (בוקר): עצרו את התגובה ומדדו.

1. הוסף 110 μL 1M Na₂CO₃ כדי לעצור את התגובה ולתעד את הזמן.
2. מערבולת וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3000 x גרם ו 21 ° C.
3. קח 125 μL של supernatant באמצעות רב ערוצי ולמדוד OD₄₂₀.
   הערה: זהירות, אין לוותר על הטיפה האחרונה כדי למנוע בועות.

טבלה 1: המתכון לפתרונות המשמשים בפרוטוקול. הטבלה מספקת את המתכון למלאי ולפתרונות העבודה של המאגרים העיקריים המשמשים בבדיקה.

TE buffer 10X (10 מ"ל)
רצוי	מן המניה
1000mM Tris-Cl (pH 8.0)	1 מ"ל של טריס 1 מטר
10mM EDTA (pH 8.0)	200uL של EDTA 0.5M
לפצות את הנפח עם מים
TE/LiAc (10 מ"ל)
רצוי	מן המניה
פי 1	1 מ"ל TE 10X
0.1 מיליון LiAc	1 מ"ל LiAc 1M
לפצות את הנפח עם מים
TE/LiAc/PEG (50 מ"ל) 50%
רצוי	מן המניה
פי 1	5 מ"ל TE 10X
0.1 מיליון LiAc	5 מ"ל LiAc 1M
40 מ"ל PEG3350
Z-buffer (1L) pH 7.0
Na2HPO4 16.1g של heptahydrated או 8.52g של נטול מים
NaH2PO4 5.5g של hydrated או 4g של נטול מים
KCl 0.75g
MgSO4 0.246g של hydrated או 0.12g של נטול מים
לשמור על pH עם HCl
כל הפתרונות עוברים סטרילינג לפני השימוש.
לוחות מדיה ואגר המשמשים בפרוטוקול (YPDA, SD-Ura; צלחות אגר SD-Trp-Ura ו-SD-Trp-Ura) עקבו אחר אותו מתכון כמו ב-Y1H

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תחתונה עגולה 96 היטב	גריינר ביו-וואן	650101	כלי פלסטיק
בלוק באר 96 עמוק	ארה"ב סיינטיפיק	1896-2000	כלי פלסטיק
רדיד אלומיניום	ארה"ב סיינטיפיק	2923-0110	כלי פלסטיק
ערסיל	אקסל סיינטיפיק	B-100	כלי פלסטיק
2-מרקפטואתנול	פישר סיינטיפיק	034461-100	בדיקת מעבדה
ONPG	סיגמא-אולדריץ'	73660	בדיקת מעבדה
Na2CO3	סיגמא-אולדריץ'	223484	בדיקת מעבדה
נא2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	S3264	בדיקת מעבדה
נה"ה 2ת.ד. 4	סיגמא-אולדריץ'	S3139	בדיקת מעבדה
KCl	פישר סיינטיפיק	BP366-500	בדיקת מעבדה
מגסו4	סיגמא-אולדריץ'	83266	בדיקת מעבדה
HCl	פישר סיינטיפיק	SA54-4	בדיקת מעבדה
אמבט יבש	תרמו פישר		מכשיר
מערבולת	תרמו פישר		מכשיר
צנטריפוגה	אפנדורף	צנטריפוגה 5810R	מכשיר
קורא צלחות	מכשיר מולקולרי	ספקטרופוטומטר SPECTRAMAX PLUS Microplate	מכשיר
אינקובטור	תרמו פישר	דגם מס' 5250- 37 מעלות, 6250-30 מעלות	מכשיר
חממת שייקר	ניו ברנזוויק		מכשיר
אמבט מים	תרמו פישר	איזוטמפ 205	מכשיר
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP152-1	בדיקת מעבדה