מדידת פעילות מנחת מסוקים של חלבון מטרה באמצעות דופלקסים RNA המסומנים בביוטין

תקציר

מקור: Yu, L. et al., In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליך לקביעת פעילות הליקייס של חלבון מטרה כדי לשחרר את מצע dsRNA המסומן בביוטין. פעילות האנזים זוהתה על ידי ניתוח שינוי הניידות האלקטרופורטית, ואחריו בדיקת כימילומינסנציה באמצעות סטרפטווידין מצומד אנזים כימילומינסנטי.

פרוטוקול

1. הכנת חלבון

1. מבני ביטוי MOV10
   1. צור מבני ביטוי cDNA המקודדים עכבר MOV10.
      1. הגדר את תגובת השרשרת של פולימראז (PCR) עבור כל מקטע. ערבוב 1 μL של cDNA עכבר (מ C57BL / 6 עכבר testis), 1 μL של dNTP, 2 μL של 10 μM פריימר קדימה, 2 μL של 10 μM פריימר הפוך, 1 μL של DNA פולימראז, 25 μL של 2x PCR buffer, ו 18 μL של זיקוק כפול H₂O (ddH₂O) בנפח סופי של 50 μL.
         הערה: הפריימרים להגברה של מקטעי גן Mov10 מפורטים בטבלה 1.
      2. בצע תגובות PCR באמצעות התוכניות הבאות: 95°C למשך 5 דקות, 35 מחזורי חימום ב-95°C למשך 15 שניות, חישול ב-64°C למשך 15 שניות, הארכה ב-72°C למשך 20 שניות (2 דקות להארכת MOV10 באורך מלא), והארכה סופית ב-68°C למשך 7 דקות.
   2. לנתח את ה- DNA PCR מוגבר על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לחתוך את הרצועה של הגודל הנדרש מן הג'ל במהירות תחת מנורת UV, ומניחים אותו לתוך צינור צנטריפוגה.
      הערה: גודל המוצר הצפוי הנראה על ג'ל האגרוז עבור MOV10 הוא 3015 bp.
   3. לטהר את ה- DNA PCR עם ערכת מיצוי ג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      1. הוסף נפח שווה של חיץ המסה לתוך צינור הצנטריפוגה משלב 1.1.2 והמיס את הג'ל באמבט מים של 50-55 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, תוך הבטחת חתיכות הג'ל נמסות לחלוטין. צנטריפוגה קצרה כדי לאסוף את כל הטיפות מדופן הצינור.
         הערה: ריכוז המסה/נפח של הג'ל והמאגר המומס הוא 1 מ"ג/מיקרוליטר.
      2. מניחים את עמוד הספיחה בצינור האיסוף, מעבירים את התמיסה המכילה את שבר הג'ל המומס לעמודת הספיחה וצנטריפוגה בגודל 12,000 x גרם למשך 2 דקות.
      3. יש להשליך את התסנין בתחתית צינורות האיסוף. הוסף 600 μL של חיץ הכביסה לעמוד, צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 1 דקה, ולזרוק את הסנין.
      4. חזור על שלב 1.1.3.3 פעם אחת.
      5. החזירו את העמוד לצינור האיסוף, והצנטריפוגה בגודל 12,000 x גרם למשך 2 דקות כדי להסיר את כל מאגר הכביסה שנותר.
      6. מניחים את עמוד הספיחה בצינור צנטריפוגה מעוקר 1.5 מ"ל, מוסיפים 50 μL של ddH₂O למרכז עמוד הספיחה, וצנטריפוגה ב 12,000 x גרם למשך דקה אחת. מודדים את ריכוז ה- DNA של הפולט באמצעות ספקטרופוטומטר.
   4. הגבלת העיכול של פלסמידים
      1. עיכול וקטור pRK5 עם BamHI ו- XhoI על ידי ערבוב 4 מיקרוגרם של וקטור pRK5, 5 μL של חיץ עיכול 10x, 1 μL של BamHI, ו- 1 μL של XhoI ו- ddH₂O לנפח תגובה סופי של 50 μL. דגירה ב- 37 ° C למשך שעתיים.
   5. לנתח את ה- DNA הווקטורי על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לחתוך את רצועת הגודל הרצוי מן הג'ל במהירות עם אזמל מתחת למנורת UV ומניחים אותו לתוך צינור צנטריפוגה.
   6. לטהר את הדנ"א הווקטורי עם ערכת מיצוי ג'ל כמו 1.1.3 בהתאם להוראות היצרן.
   7. הגדר תגובת קשירה רקומביננטית סטנדרטית על ידי שילוב של 0.03 pmol של וקטור ליניארי, 0.06 pmol של מקטע cDNA, 2 μL של ליגאז, ו- 4 μL של מאגר ליגאז 5x ו- ddH₂O בנפח תגובה סופי של 10 μL.
      הערה: שכפל את MOV10 לווקטור pRK5.
   8. לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן לקרר את התגובה מיד במשך 5 דקות על קרח. הפוך פלסמידים רקומביננטיים MOV10 לחיידקי DH5α.
      הערה: אמת את כל המבנים הרקומביננטיים על ידי ריצוף Sanger.
   9. הכינו מלאי גליצרול של תרביות חיידקים המכילות פלסמידים רקומביננטיים מאומתים על ידי הוספת נפח שווה של 50% גליצרול לתרביות נוזליות, ואחסון בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: עבור כל ניסוי עוקב, פזרו חיידקים ממאגרי גליצרול על צלחת אגר טרייה והשתמשו במושבה אחת לצורך ההתפשטות כמתואר בשלב 1.2.
2. תמציות חלבון MOV10 מתאי HEK293T
   1. לבטא באופן ארעי את חלבוני MOV10 בתאי HEK293T בתרבית.
      1. הכינו פלסמיד MOV10-pRK5 בריכוז >500 ננוגרם/מיקרוליטר.
      2. זרעו HEK293T תאים בצלחות של 15 ס"מ. כאשר צפיפות התאים מגיעה ל~70%-90%, החליפו את מדיום תרבית התאים בתווך עיט מעובד טרי של דולבקו (DMEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      3. עבור טרנספקציה אחת, לדלל 60 מיקרוגרם של DNA פלסמיד MOV10-pRK5 ב 3 מ"ל של מדיום הסרום מופחת, ולאחר מכן להוסיף 120 μL של מגיב משפר transfection, ולערבב היטב.
      4. בצינור נפרד לדלל 90 μL של מגיב transfection עם 3 מ"ל של בינוני בסרום מופחת (ללא פניצילין-סטרפטומיצין) ומערבבים היטב.
      5. הוסף את ה- DNA המדולל לכל צינור של מגיב טרנספקציה מדולל. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      6. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתרבית התא, ותאי תרבית למשך ~36-48 שעות.
   2. לאחר 36-48 שעות, לאסוף תאים מכל צלחת בצינור 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשטוף כל גלולה עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, ולאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   3. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של חיץ ליזה תאי המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז מלא נטול חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA). דוגרים במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה את הליזט ב 20,000 x גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות.
   4. הוסף 100 μL של חרוזים מגנטיים נגד FLAG לכל צלחת של תאים בצינור של 1.5 מ"ל.
   5. שטפו את החרוזים המגנטיים 2x עם חיץ K150 (50 mM HEPES ב-pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0.1% NP-40).
      1. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים ב 1 מ"ל של חיץ K150 קר כקרח.
      2. לדגור את החרוזים המגנטיים במשך 2 דקות ב 4 ° C עם סיבוב עדין ו pellet את החרוזים המגנטיים בעזרת מגנט. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
   6. הוסף את החרוזים המגנטיים לתא ליזט סופרנאטנט משלב 1.3.3 ודגר ב 4 ° C במשך 2 שעות.
   7. שטפו את החרוזים המגנטיים הקשורים לחלבון 3x עם חיץ K150, לאחר מכן 2x עם K150 המכיל 250 mM NaCl, ואז 3x עם חיץ K150 כמו 1.3.5.
   8. יש להשהות מחדש את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של חיץ אלוציה FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl ב-pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 10% גליצרול), להוסיף פפטיד FLAG לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/μL, ולדגור עם חרוזים על מסובב ב-4°C למשך שעה אחת, ואז לגרוף את החרוזים המגנטיים בעזרת מגנט.
   9. אספו את הסופרנאטנט המכיל את חלבוני MOV10 המדוללים, קבעו את הריכוז ואחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.

2. הכנת חומצות גרעין

1. רכשו אוליגונוקלאוטידים של DNA ו-RNA (אוליגוס) עם או בלי תוויות ביוטין ממקור מתאים. לדלל כל אוליגו ב- ddH ללא RNase₂O עד 20 μM ולשמור אותו ב -80 ° C לשימוש עתידי.
   הערה: רצפי האוליגו של מצעי דנ"א/רנ"א ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 2.
2. הכינו את התערובת הבאה לתגובת החישול של RNA דו-גדילי (dsRNA) עבור בדיקת פעילות הליקז MOV10: ערבבו 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid (HEPES) ב-pH 7.5, 6 mM KCl, 0.2 mM MgCl₂ ו-ddH₂O נטול RNase בנפח תגובה סופי של 20 μL.
3. אוליגוס RNA אנאלי ליצירת דופלקס RNA על ידי חימום תערובת של הגדיל העליון המסומן בביוטין (2 מיקרומטר, ריכוז סופי) ופי 1.5 של הגדיל התחתון המשלים הבלתי מסומן שלו בחיץ החישול (שלב 2.2) ב 95 ° C למשך 5 דקות, ולאחר מכן לקרר אותו לאט לטמפרטורת החדר (RT).

3. בדיקות ביוכימיות במבחנה

1. EMSA ותגובות אנזימטיות
   1. לבדיקת פעילות הליקז MOV10, יש לערבב 50 mM Tris-HCl ב- pH 7.5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl₂, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL RNase inhibitor, 10 nM מצע RNA מסומן בביוטין, 2 mM אדנוזין טריפוספט (ATP), מלכודת RNA של 100 ננומטר, ו- 20 ng של חלבון MOV10 ו- ddH₂O בנפח תגובה סופי של 20 μL. לדגור על תערובת התגובה ב 37 ° C במשך 10 דקות, 30 דקות ו-60 דקות. הוסף את מאגר העצירה 5x כדי לעצור את התגובה.
      הערה: מלכודת RNA, אוליגו ללא תווית ביוטין עם רצף, משלימה לאוליגו המסומן, המונעת מה-dsRNA הלא פצוע להתנשל שוב.
2. ג'ל פוליאקרילאמיד
   1. שטפו את לוחות הג'ל (16X16 ס"מ) ומסרקי 1.5 מ"מ. להרכיב את יחידות אלקטרופורזה ג'ל.
   2. להכנת ג'ל פוליאקרילאמיד 10% טבעי, יש לערבב 14 מ"ל של ddH₂O, 1.25 מ"ל של 10x Tris-boric acid-EDTA (TBE), 8.3 מ"ל של 30% אקרילאמיד, 1.25 מ"ל של 50% גליצרול, 187.5 μL של 10% אמוניום פרסולפט טרי (APS), ו-12.5 μL של טטרמתילאתילאנדיאמין (TEMED).
   3. להכנת ג'ל פוליאקרילאמיד 20% טבעי, יש לערבב 5.5 מ"ל של ddH₂O, 1.25 מ"ל של 10x TBE, 1.25 מ"ל של 50% גליצרול, 16.7 מ"ל של 30% אקרילאמיד, 187.5 מיקרוליטר של 10% APS ו-12.5 מיקרוליטר של TEMED.
   4. יוצקים את תמיסת האקרילאמיד מיד לג'ל ומכניסים את המסרק. תנו לתערובת להתפלמר במשך כ-30 דקות.
3. ריצת ג'ל
   1. הסר את המסרק ומלא את המיכלים במאגר האלקטרופורזה (0.5x TBE).
   2. שטפו את בארות הדגימה עם חיץ TBE של 0.5x, ולאחר מכן הפעילו מראש את הג'ל ב-100 וולט על קרח למשך 30 דקות. החליפו את מאגר הריצה ב-0.5x TBE טרי.
   3. טען 20-25 דגימות μL לתוך כל באר.
   4. השתמש בג'ל אקרילאמיד 10% טבעי לבדיקת EMSA וג'ל אקרילאמיד 20% טבעי לבדיקות האנזימטיות. הפעל אלקטרופורזה ב 100 V על אמבט הקרח עד שהסמן הכחול ברומופנול נדד לרבע התחתון של הג'ל.
4. לפרק את לוחות הג'ל, ולקצץ את הג'ל על ידי הסרת בארות טעינה ונתיבים שאינם בשימוש. מניחים את הג'ל במאגר TBE של 0.5x.
5. חותכים את נייר הסינון ואת קרום הניילון לגודל הג'ל. הרטיבו מראש את נייר הפילטר הנקי ואת קרום הניילון.
6. הרכיבו את הערימה להעברה.
   1. הניחו את הממברנה הטרום-רטובה על נייר הסינון הטרום-רטוב.
   2. מניחים את הג'ל על הממברנה.
   3. מכסים את הג'ל בשכבה נוספת של נייר סינון טרום רטוב.
   4. הסירו את כל בועות האוויר על ידי גלגול פיפטה נקייה מהמרכז לקצה.
7. מעבירים את הדגימות מהג'ל לממברנה במכשיר אלקטרופורטי חצי יבש ב 90 mA למשך 20 דקות.
8. עצור את ההעברה, ולאחר מכן יבש את הממברנה על נייר סינון חדש במשך 1 דקה.
9. הצלבת הדגימות על ידי הקרנת הממברנה ב 120 mJ / cm² עבור 45-60 s ב crosslinker אור UV מצויד נורות 254 ננומטר (פונקציית crosslink אוטומטית). יבשו את הממברנה באוויר ב-RT למשך 30 דקות.
10. זיהוי כימילומינסנציה
    1. פרוטוקול 1: השתמש בנפח סטנדרטי של ערכה מסחרית לזיהוי חומצות גרעין כימילומינסנטיות.
       1. מוסיפים 20 מ"ל של חיץ חוסם לממברנה ודגרים במשך 15-30 דקות עם טלטול עדין על מסובב ב 20-25 סל"ד.
       2. הכן תמיסת חיץ מצומד/חוסם על ידי הוספת 66.7 מיקרוליטר סטרפטווידין-חזרת מיוצבת פרוקסידז מצומדת ל-20 מ"ל של חיץ חוסם.
       3. הסר בעדינות את מאגר החסימה והחלף אותו במאגר מצומד/חוסם. דגירה במשך 15 דקות על מסובב ב 20-25 סל"ד.
       4. שטפו את הממברנה 4x עם רעד ב 40-45 סל"ד במשך 5 דקות כל אחד.
       5. הוסף 30 מ"ל של חיץ שיווי משקל מצע לממברנה. דוגרים על הממברנה במשך 5 דקות עם רעידות ב 20-25 סל"ד.
       6. הכן פתרון עבודה למצע על ידי הוספת 6 מ"ל של תמיסת לומינול/משפר ל-6 מ"ל של תמיסת מי חמצן יציבה. יש להימנע מאור.
       7. מכסים את כל פני השטח של הממברנה בתמיסת עבודה של המצע ודגרים במשך 5 דקות.
       8. סרוק את הממברנה במערכת הדמיה כימילומינסנטית במשך 1-3 שניות.

טבלה 1: פריימרים המשמשים ל-PCR מגבירים את מקטעי הגנים של Meiob ו-Mov10.האותיות המודגשות בפריימרים קדימה ואחורה הן אתרי חיתוך BamHI ו-NotI; האותיות המודגשות הנטויות בפריימר הפוך הן אתרי חיתוך XhoI; האותיות המודגשות בתיבות מציינות את הנוקלאוטידים המתאימים למוטציה הנקודתית R235A.

שברי	פריימרים	רצפים (מ-5' עד 3')
MEIOB-A	קדימה	CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	הפוך	ב-GCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	קדימה	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	הפוך	CGATGCGGCCGCCTCTTTTTTTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	קדימה	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	הפוך	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	קדימה	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	הפוך	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	קדימה	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	הפוך	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCTCTCCACTCTCTG

טבלה 2: רצפים של מצעי דנ"א/רנ"א ששימשו בעבודה זו.

לאיורים	שמות	רצפים (מ-5' עד 3')
איור 2, 5	36 nt ssDNA	5'-ביוטין-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA)
תרשים 3	36 nt ssRNA	5'-Biotin-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (RNA)
תרשים 4	54 nt 5'-זנב dsRNA	5'-Biotin-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד
צנטריפוגה	Eppendorf, גרמניה	5242R
מערכת הדמיה כימילומינסנטית	Tanon, סין	5200
סוניפר דיגיטלי	Branson, ארצות הברית	BBV12081048A	450 וואט; 50/60 הרץ
בלוטר אלקטרופורטי חצי יבש	Hoefer, ארצות הברית	TE77XP
אקדח צינור	Crystal, ארצות הברית	3406051
קרוס-לינקר אור UV	UVP, ארצות הברית	CL-1000
חומרים
קרום ניילון	Thermo Scientific, ארצות הברית	TG263940A
מנת תרבות מטופלת TC	Corning, ארצות הברית	430167	100 מ " מ
מנת תרבות מטופלת TC	Corning, ארצות הברית	430597	150 מ"מ
צינורות מיקרו-צינוריות	AXYGEN, ארצות הברית	MCT-150-C	1.5 מ"ל
צינורות	Corning, ארצות הברית	430791	15 מ"ל
ריאגנטים
חרוזים מגנטיים נגד FLAG M2	Sigma, ארצות הברית	M8823
ATP	Thermo Scientific, ארצות הברית	591136
ערכת פיתוח צבע BCIP/NBT אלקליין פוספטאז	Beyotime, סין	C3206
CelLyticTM M מגיב ליזיס תאי	Sigma, ארצות הברית	107M4071V
ערכת שיבוט שלב אחד ClonExpress II	Vazyme, סין	C112
ערכה לזיהוי חומצות גרעין Chemiluminescent	Thermo Scientific, ארצות הברית	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, ארצות הברית	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, ארצות הברית	10569044
EDTA	Invitrogen, ארצות הברית	AM9260G	0.5 מטר
קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא EDTA	Roche, ארצות הברית	4693132001
ערכת מקסי פלסמיד EndoFree	Vazyme, סין	DC202
ערכת מיני מיצוי DNA בג'ל FastPure	Vazyme, סין	DC301-01
פ.ב.ס.	Gibco, ארצות הברית	10437028
פפטיד דגל	Sigma, ארצות הברית	F4799
גליצרול	Sigma, ארצות הברית	SHBK3676
חיץ HEPES	Sigma, ארצות הברית	SLBZ2837	1 מטר
KOAc	Sangon Biotech, סין	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, ארצות הברית	AM9530G	1 מטר
NaCl	Invitrogen, ארצות הברית	AM9759	5 דקות
NP-40	Amresco, ארצות הברית	M158-500ML
Opti-MEM בינוני	Gibco, ארצות הברית	31985062
PBS	Gibco, ארצות הברית	10010023	pH 7.4
מעכב RNase	Promega, ארצות הברית	N251B
Streptavidin אלקליין phosphatase	Promega, ארצות הברית	V5591
טיב	Invitrogen, ארצות הברית	15581044
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, ארצות הברית	15567027	1 מטר, pH 7.4
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, ארצות הברית	15568025	1 מטר, pH 8.0
טווין-20	Sangon Biotech, סין	A600560