מאמר שיטה

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: de la Peña Avalos, B., et al., Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (2020).

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיצוי גרעיני וקיבוע תאים

  1. הכינו פתרונות מלאי: 0.2 M צינורות (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M סוכרוז, 1 M MgCl2, 0.1 M EGTA (pH 8.0).
  2. הכן חיץ מיצוי גרעיני (NEB): להמיס צינורות 10 mM (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) ו- 0.5% (v/v) Triton X-100 ב- ddH2O. מערבבים עד להמסה מלאה.
  3. הכן 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA): להמיס 10 מ"ל של תמיסה מימית PFA 16% ב 30 מ"ל PBS. מערבבים עד להמסה מלאה.
  4. בנקודת הזמן המתאימה (t = 0, 1, 2, 4, 16 שעות), לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS. הסר את PBS לחלוטין.
  5. הוסיפו 200 מיקרוליטר של NEB לכל באר לצורך מיצוי גרעיני תאים (הציטופלסמה מתפרקת, רק הגרעין נשאר) (איור 1). יש לדגור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר לחלוטין.
    הערה: אין לחרוג מ-2 דקות.
  6. לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS. הסר את PBS לחלוטין. הוסף PBS בזהירות, תאים שבירים מאוד בשלב זה.
  7. הוסף 200 μL של 4% (v/v) PFA לכל באר לצורך קיבוע תאים. יש לדגור במשך 10 דקות ב-4°C. יש להסיר את ה-PFA לחלוטין.
  8. הוסף 1 מ"ל של PBS.
    הערה: תאים יכולים להיות מאוחסנים PBS ב 4 °C.

2. צביעת אימונופלואורסנציה

  1. הכן פתרון חסימה: יש להמיס 5% BSA (w/v) ב-PBS ולהוסיף 0.3% (v/v) Triton X-100. מערבבים עד להמסה מלאה.
  2. הכינו מאגר דילול: המסו 1% BSA (w/v) ב-PBS והוסיפו 0.3% (v/v) Triton X-100. מערבבים עד להמסה מלאה.
  3. לחסימה, הוסף 200 מיקרוליטר של פתרון חסימה לכל באר. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או 16-18 שעות בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: אם נעשה שימוש בנוגדן עיזים, יש להוסיף סרום עיזים 5% לתמיסה חוסמת.
  4. לדלל נוגדנים ראשוניים במאגר דילול (1:500; ראה טבלה 1 לרשימת נוגדנים) ומערבולת עד לערבוב טוב.
    הערה: אם נעשה שימוש בנוגדן עיזים, יש להוסיף סרום עיזים 1% למאגר הדילול.
  5. בקופסת לחות/דגירה, הדביקו חתיכת פרפילם. הוסף 10 μL של נוגדן ראשוני (בטיפה אחת). יישרו קצה אחד של הכיסוי עם הטיפה והורידו לאט לאט על הפרפילם, כדי שהנוזל יתפזר לכל אורכו (הימנעו מבועות במידת האפשר). דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  6. יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים ב-PBS למשך דקה.
  7. מדללים נוגדנים שניוניים במאגר דילול (ריכוז סופי: 2 מק"ג/מ"ל) ומערבולות עד לערבוב טוב.
  8. יש למרוח 10 μL של נוגדן משני כמתואר עבור הנוגדנים הראשוניים. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש להגן מפני אור.

טבלה 1: נוגדנים בשימוש. רשימת נוגדנים ששימשו במחקר זה.

נוגדןחברההפניהמקור
53BP1איתות סלולרי4937ארנב
נגד עכבר IgG H&L (Alexa Fluor 647)אבקאםab150103חמור
אנטי פוספו-היסטון H2A. X (Ser139), שיבוט JBW301מיליפור05-636עכבר
נגד ארנב IgG H&L (Alexa Fluor 488)אבקאםab150081עז
  1. יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים ב-PBS למשך דקה.
  2. יש לשטוף את החלקות עם H2O למשך דקה.
  3. DNA נגד כתמים עם DAPI: יש למרוח 10 μL של 300 ננומטר DAPI (כמתואר עבור נוגדנים), לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להרכיב על מגלשת זכוכית עם אמצעי הרכבה מבוסס גליצרול. לחלופין, הוסף טיפה אחת (10 μL) של מדיה מסחרית להרכבה נגד דעיכה המכילה DAPI על שקופית והחל תלוש כיסוי. לחצו בעדינות על הכיסוי והוציאו את עודפי הנוזלים סביבו בעזרת מגבת נייר.
  4. אטמו את הכיסויים בלק שקוף והניחו להם להתייבש במשך 20 דקות.
  5. יש לאחסן שקופיות בטמפרטורה של 4°C.

3. רכישת תמונות

  1. יש להניח טיפת שמן טבילה על עדשת האובייקט 60x. השתמש ב- DAPI כדי לאתר את הגרעינים דרך פיסת העין.
    1. לרכישת תמונות XYZ, פתח תוכנת רכישה ובחר פרמטרים: סוג סורק: Galvano; מצב סורק: הלוך ושוב; גודל תמונה: 512×512; מצב PMT: VBF; ממוצע PMT: מסגרת (4 פעמים); סריקה רציפה PMT: קו.
    2. בחר את הצבע ואת הגלאים:
      ערוץ (CH1), צבע (DAPI), גלאי (SD1)
      ערוץ (CH2), צבע (Alexa Fluor 488), גלאי (HSD3)
      ערוץ (CH3), צבע (Alexa Fluor 647), גלאי (HSD4)
    3. בחר מופעל ב- "Z".
  2. התאם את התמונה החיה. לחץ על הלחצן Live בחלון Live.
    1. התאם את המיקוד והגדר עוצמת לייזר (%), רגישות (HV), רווח והיסט בחלון הכלים "PMT".
      1. כוונן את עוצמת הלייזר (%): לבהירות ולהלבנה. ככל שעוצמת הלייזר גבוהה יותר, כך האות חזק יותר, אך הדגימה תצלם אקונומיקה.
      2. כוונן את הרגישות (HV): רמת רעש. ככל שה- HV גבוה יותר, כך האות חזק יותר, אך התמונה תהיה רועשת אם גבוהה מדי.
        הערה: שמור תמיד על מתח קבוע.
      3. התאמת ההסטה: רמת רקע.
    2. בחרו 'התחל/סיום' (15 פרוסות) בערימות Z.
  3. התחל את הרכישה.
    1. בחרו בתיקייה לשמירת תמונות. לחץ על לחצן התחל של LSM כדי להתחיל לרכוש את התמונה. לחץ על הלחצן Series Done כדי להשלים את רכישת התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. מיצוי גרעיני.

תמונות מייצגות של תאים לפני (משמאל) ואחרי (מימין) מיצוי גרעיני. הציטופלסמה צריכה להיות מעוכלת אך המבנה הגרעיני צריך להישאר שלם לאחר המיצוי (מימין). (א) הגדלה פי 20; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר ו- (B) הגדלה פי 40; סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זכוכית כיסוי #1, 18 מ"מ עגול (כיסויים)נויבטרוNC0308920לנקות ולעקר את הכיסויים לפני השימוש, עם HCl או אתנול.
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםגיבקו14190144PBS לתרבית רקמות
הרכבה נגד דהייה של יהלום SlowFade עם DAPIInvitrogenS36973במקום זאת, ניתן להשתמש ב- DAPI של 300 ננומטר עם VECTASHIELD Antifade Mounting Medium.
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'A3059מומלץ לבצע מקטע הלם חום, כדי למנוע משקעים / רקע.
טריטון X-100אמריקנביוAB02025חיץ מיצוי גרעיני.
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plusפישרברנד1255015ניתן להשתמש במגלשות פוליזין במקום זאת.
יש

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNADAPIZ stack

מאמרים קשורים