RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

תקציר

מקור: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity תיווך טיהור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם RNA בתאי מזותליומה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

פרוטוקול

1. הכנת מקטע חלבון ציטוסולי וגרעיני

1. צלחת 4 x 10⁶ תאי ACC-MESO-4 בבקבוק תרבית תאים T150 גדל בסל"ד - 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 1x פניצילין/סטרפטומיצין (100x) ו-2 mM L-גלוטמין (200 מילימול). כאשר תאים מגיעים למפגש של 80-90% (~ 5-5.5 x 10⁶ תאים), המשיכו במיצוי חלבונים של שברים גרעיניים וציטוסוליים.
   הערה: קו התאים ACC-MESO-4 התקבל ממרכז RIKEN BioResource Centre.
2. שאפו בינוני, שטפו את התאים על ידי הוספת 15 מ"ל של 1x PBS, הטו את הצלחת בעדינות כמה פעמים, ושאפו את 1x PBS. הוסיפו 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגרו על בקבוק התרבית בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות
   הערה: תסתכל על התאים מתחת למיקרוסקופ לניתוק; אם עדיין מחובר, יש להקיש את הבקבוק על כף היד 3 פעמים.
3. הוסף 7 מ"ל של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 1x פניצילין/סטרפטומיצין (100x) ו-2 mM L-גלוטמין (200 mM), אסוף את התאים בצינור של 15 מ"ל, וסובב כלפי מטה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
4. לשאוף בינוני ולהשעות מחדש את גלולת התא עם 1.5 מ"ל של 1x PBS, ולאחר מכן להעביר את התאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. יש לסחוט כלפי מטה בטמפרטורה של 500 x גרם ו-4°C למשך 5 דקות. בטל את supernatant.
   הערה: משלב זה ואילך, בצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב -4 מעלות צלזיוס ושמור את כל הריאגנטים על קרח.
5. השהה מחדש את גלולת התא עם 1.5 מ"ל קר כקרח של 1x PBS וסחרר את התאים ב 500 x g ו 4 ° C במשך 3 דקות. השליכו את supernatant.
   הערה: הכמויות הנדרשות של ריאגנטים CER I, CER II ו-NER הן 10, 0.55 ו-5 נפחים של נפח כדורי תא משוער, בהתאמה; הפרוטוקול הבא מניח נפח של 20 μL. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של מגיב CER I.
6. הוסף 200 μL של מגיב מיצוי ציטופלזמי קר כקרח (CER I) בתוספת 2 μL של מעכב פרוטאינאז 1x, למשל, לדלל 1 טבליה של מעכב פרוטאז (ללא EDTA) ב 500 μL של מים כדי לקבל מלאי 100x. כמות זו של מגיב CER I מספיקה כדי lyse 20 μL של נפח תא ארוז כדורים.
   1. כדי להעריך את נפח כדורי התא, השווה את הצינור המכיל את גלולת התא עם צינור של 1.5 מ"ל מלא ב- 10, 20, 50 או 100 μL של 1x PBS.
7. השהה מחדש את גלולת התא על ידי ערבול נמרץ של הצינור במשך 15 שניות ודגר על הצינור על קרח למשך 10 דקות. הוסף 11 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ציטופלזמי קר כקרח II (CER II) לצינור, מערבל במרץ במשך 5 שניות, ודגר במשך דקה אחת על קרח.
8. מערבלים במרץ במשך 5 שניות וצנטריפוגות את הצינור ב 16,000 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור הנקי המצונן מראש על קרח. הסופרנאטנט הוא החלק הציטופלזמי המשמש בהמשך בניסוי משיכת הרנ"א.
9. יש להשהות מחדש את הגלולה הנותרת ב-100 μL של מגיב מיצוי גרעיני קר כקרח (NER) בתוספת 1 μL של מעכב פרוטאינאז (100x) ולערבל במרץ במשך 15 שניות. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של מגיב NER בתוספת מעכבי פרוטאזות.
10. דגרו את הדגימה על קרח במשך 40 דקות עם מערבולות מזדמנות במשך 15 שניות (כל 10 דקות).
11. צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 x גרם למשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט (זהו חלק החלבון הגרעיני) לצינור נקי ומקורר מראש.
12. המשך מיד על ידי מדידת ריכוז חלבון בשיטה bicinchoninic (BCA) (ראה טבלה של חומרים). כדי לשלוט בטוהר החלבונים של כל שבר, בצעו אימונובלוטציה (איור 1) נגד α-טובולין (זיהוי חיובי רק במקטע הציטוסולי) ופולי ADP-ריבוז פולימראז – PARP (זיהוי חיובי רק בחלק הגרעיני).
13. על מנת לשמור על פעילות החלבונים ומצבם הטבעי, הכינו 25 מיקרוליטר של אליציטוטים של תמציות ציטוסוליות וגרעיניות. הצמד להקפיא aliquots אלה על ידי הצבתם בחנקן נוזלי במשך 5 s ולאחסן ישירות ב -80 ° C.

2. תיוג RNA עם Desthiobiotin

1. יש בדיקות RNA מסונתז מסחרית HPLC מטוהר. יש להשהות מחדש עם מים נטולי נוקלאז בטמפרטורה של 10 μM.
   הערה: רצפי בדיקה מפורטים בטבלה 1.
2. השתמש 50 pmol של RNA לכל RNA משיכה תגובה. הפשירו ושמרו את כל הריאגנטים על קרח למעט PEG 30%, המשמש לסימון 3' terminus של RNA oligo.
3. העבירו 5 μL של 10 מיקרומטר RNA probes, המסומנים כ-CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) ו-Unrelated-RNA (IRE), לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות דקיקות של 0.5 מ"ל ודגרו במכונת PCR בטמפרטורה של 85°C למשך 5 דקות. הניחו את הצינורות מיד על ice.
   הערה: צעד זה חשוב, שכן הוא מקדם את ההרפיה והנגישות של בדיקת RNA לתיוג.
4. לתגובה יחידה של 30 μL, יש להוסיף לצינור המכיל RNA את תערובת 10 μL הבאה: 3 μL מים נטולי נוקלאז, 3 μL של 10x RNA Ligase Reaction Buffer, 1 μL של מעכב RNase (40 U/μL), 1 μL של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 mM), ו-2 μL של T4 RNA ligase (20 U/μL).
   הערה: כדי להכין תערובת אב A עבור 3 דגימות עודפות (3.2), לערבב 9.6 μL של מים נטולי nuclease, 9.6 μL של 10x RNA Ligase Reaction Buffer, 3.2 μL של מעכב RNase (40 U/μL), 3.2 μL של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 mM), ו 6.4 μL של T4 RNA ligase (20 U/μL).
5. הוסף בזהירות 15 μL של PEG 30% לתגובה. השתמש בטיפ נוסף כדי לערבב את התגובה. לדגור את התגובה לילה ב 16 °C (75 °F).
6. למחרת, הכינו את הדברים הבאים: 5 M NaCl (טרי/נטול נוקלאז), כלורופורם: איזואמיל אלכוהול ביחס של 24:1 (למשל, לכל תגובה - 96 מיקרוליטר כלורופורם ו-4 מיקרוליטר איזואמיל אלכוהול), 100% אתנול קר כקרח ואתנול 70% קר כקרח.
7. הוסף 70 μL של מים נטולי נוקלאז לצינורות התגובה לסימון RNA. מוסיפים 100 μL של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל ומערבולת לזמן קצר. סחרור כלפי מטה במהירות של 13,000 x גרם למשך 3 דקות. בזהירות להסיר רק את השלב העליון ולהעביר צינור חדש ללא nuclease 1.5 מ"ל; הימנע מלגעת בשלב התחתון.
8. הוסף 10 μL של 5 M NaCl, 1 μL של גליקוגן, ו 300 μL של 100% אתנול קר כקרח. מניחים את הצינור ב -20 ° C למשך 2 שעות
   הערה: בשלב זה, ניתן להמשיך את הניסוי למחרת.
9. צנטריפוגה בטמפרטורה של 13,000 x גרם ו-4°C למשך 15 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור. הוסף 300 μL של 70% אתנול קר כקרח וצנטריפוגה שוב ב 13,000 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות.
10. יש להשליך את הסופרנאטנט לחלוטין ולייבש את הגלולה באוויר (15 דקות). להשהות מחדש את הגלולה ב 20 μL של מים ללא nuclease.
    הערה: המשך עם משיכת RNA באותו יום.
11. לדגור את RNA ב 90 ° C במשך 2 דקות ומניחים אותו על קרח. הניחו את הרנ"א המסומן על הקרח במהלך השלב הבא של שטיפה מראש של החרוזים המגנטיים סטרפטאבידין.
    הערה: זמן דגירה ארוך יותר עלול לפגוע בבדיקת הרנ"א.

3. RNA-Protein Pulldown

1. טרום שטיפת חרוזים סטרפטווידין-מגנטיים ודגירה עם desthiobiotin-RNA
   1. השתמש 50 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin לכל 50 pmol RNA. עם זאת, זה צריך להיות אופטימלי בהתאם לניסוי.
   2. מערבבים את הצינור עם חרוזים מגנטיים סטרפטווידין למשך 15 שניות, ומוציאים במהירות 200 מיקרוליטר (תערובת מאסטר; מספיק לתגובות 3+1) לתוך צינור נקי של 1.5 מ"ל לנעילה בטוחה באמצעות קצות פיפטה חתוכים. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי כך שהחרוזים ייאספו בצד הצינור והמתינו דקה. הסר את נוזל התרחיף.
   3. כדי לשטוף את החרוזים, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 400 μL של תמיסת 0.1 M NaOH ו- 0.05 M NaCl, ומזלף בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. החזירו את הצינור למעמד המגנטי. חכו דקה ואספו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה שוב.
   4. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 100 mM NaCl. הסר את supernatant.
   5. מוסיפים 200 μL של 20 mM Tris (pH 7.5), מרחפים חרוזים על ידי פיפטינג, מניחים את הצינור על המעמד המגנטי, ממתינים דקה ומסירים את הסופרנטנט. חזור על השלב.
   6. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 200 μL של מאגר לכידת RNA 1x, והשהה מחדש חרוזים מגנטיים סטרפטווידין על ידי מערבול קצר. הסר 50 μL של חרוזים מגנטיים סטרפטאווידין והוסף לכל צינור RNA מסומן באמצעות קצה פיפטה חתוך. דוגרים על הצינורות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גליל.
2. קשירת החלבון לרנ"א
   1. הכניסו את הצינורות למעמד מגנטי, המתינו דקה והסירו את הסופרנטנט.
   2. הוסף 50 μL של 20 mM Tris (pH 7.5) לחרוזים והשהה מחדש על ידי pipetting. הכניסו את הצינורות למעמד מגנטי, המתינו דקה והסירו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה.
   3. הוסף 100 μL של 1x חיץ קשירת חלבון-RNA לחרוזים והשהה מחדש על ידי pipetting.
   4. בינתיים, הכינו את התערובת הבאה: 10 μL של 10x חיץ קשירת חלבון-RNA, 30 μL של 50% גליצרול, 50 מיקרוגרם של חלבונים ציטופלזמיים, ומים נטולי נוקלאז עד 100 μL.
      הערה: הכינו תערובת מאסטר B עבור 3 דגימות עודפות (3.3) כדלקמן: 33 μL של 10x חיץ קשירת חלבון-RNA, 99 μL של 50% גליצרול, 165 מיקרוגרם של חלבונים ציטופלזמיים ומים נטולי נוקלאז עד 330 μL. שמור את הצינור של תערובת מאסטר B על קרח.
   5. הכניסו את הצינורות למעמד המגנטי, המתינו דקה ואספו את הסופרנטנט. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תערובת מאסטר B, מרחפים מחדש על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה, ונמנעים מיצירת בועות. לדגור צינורות תגובה במשך 60 דקות ב 4 ° C על רולר.
3. כביסה ו elution
   1. מניחים את הצינורות במעמד מגנטי, אוספים את הסופרנאטנט (שזורם דרכו - FT), ומעבירים אותו לצינור חדש.
      הערה: שמור את FT זה על קרח לניתוח מאוחר יותר.
   2. פיפטה 100 μL של 1x לשטוף חיץ על החרוזים, להשהות בעדינות, להחזיר למעמד המגנטי, לחכות 1 דקה, ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה פעמיים.
   3. הוסיפו 40 μL של חיץ Elution לחרוזים המגנטיים, ערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ודגרו בטמפרטורה של 37°C על שייקר צינור (950 סל"ד) למשך 30 דקות.
   4. הכניסו את הצינורות למעמד מגנטי, המתינו דקה ואספו את הדגימה המדוללת (שהיא פולטת - E). מניחים על קרח ומשתמשים לניתוח במורד הזרם.
      הערה: בשלב זה, כל בדיקת RNA נבדקת מורכבת מדגימת זרימה (FT) ופליטה (E).

תוצאות

איור 1: ניתוח כתם מערבי של 5 מיקרוגרם של מקטע חלבון ציטוסולי וגרעיני. חלבון PARP קיים בחלק הגרעיני (N) אך נעדר מהמקטע הציטוסולי (C). α-טובולין קיים בחלק הציטוסולי (C) אך נעדר במקטע הגרעיני (N).

טבלה 1: רצפים של בדיקות RNA

בדיקת RNA

...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NE-PER ערכת מיצוי גרעינית וציטופלזמית	תרמו פישר סיינטיפיק	78833
טבליות מעכבי פרוטאז פירס, ללא EDTA	תרמו פישר סיינטיפיק	A32965
ערכת בדיקת חלבון פירס BCA	תרמו פישר סיינטיפיק	23225
ערכת משיכה של חלבון RNA מגנטי פירס	תרמו פישר סיינטיפיק	20164	כולל חרוזים מגנטיים ולכן יש לאחסן את הערכה בטמפרטורה של 4°C
פירס RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit	תרמו פישר סיינטיפיק	20163	הערכה היא חלק מ"Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", ויש לאחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בניגוד לערכה הנפתחת (4 מעלות צלזיוס).
DynaMag-2, מעמד מגנטי	תרמו פישר סיינטיפיק	12321ד
סל"ד - 1640 בינוני	סיגמא-אולדריץ'	₪220
FBS - סרום בקר מסונן	פאן ביוטק	עמ' 40-37500
פניצילין - סטרפטומיצין (100x)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4333
תמיסת L-גלוטמין (200 מילימול)	סיגמא-אולדריץ'	G7513
0.25% טריפסין-EDTA (1x)	Gibco by Life טכנולוגיות	25200-056
RNaseZap RNase פתרון טיהור	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9780
סינתזת RNA אוליגו	Mycrosynth AG, שוויץ	-	סולם הסינתזה - 0.04 μmol - HPLC-מטוהר
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A7030
חומצה הידרוכלורית (HCl) 6 מטר	PanReac AppliChem	182883.1211
טהור במיוחד 1 M Tris, pH 7.5	תרמו פישר סיינטיפיק	15567027
גליצרול	תרמו פישר סיינטיפיק	17904	50% aliquots סטריליים לאחסון בטמפרטורה של -20°C
פירס סטרפטאווידין חרוזים מגנטיים	תרמו פישר סיינטיפיק	88817	שימו לב כי לחרוזים מגנטיים אלה יש קוטר ממוצע של 1 מיקרומטר (טווח בין 0.5 - 1.5 מיקרומטר). יתר על כן, Dynabeads-M280 Streptavidin, שהם חרוזים בגודל הומוגנוז 2.8 מיקרומטר, משמשים גם במשיכת RNA, אך שימו לב שהדבר עשוי להשפיע על תהליך הטיהור.
אלומיניום סולפט-(14-18)-הידרט	סיגמא-אולדריץ'	368458
חומצה אורתו-זרחתית	אפליכם	A0637