בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון

1. תגובת קשירת חלבונים והפרדת RNA קשור

1. לבצע קשירה של חלבון ורנ"א ב 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 בנפח של 100 μL על ידי הוספת המרכיבים הבאים לריכוזים סופיים אלה: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.09 מיקרוגרם / μL אלבומין בסרום בקר, 0.5 יחידות/μL RNasin, 0.15 מיקרוגרם / μL tRNA, 1 mM EDTA, וריכוז 30 μL של חלבון רקומביננטי מתאים (PTB). הוסף RNA מהמאגר המתאים.
   הערה: גורם השחבור U2AF65 נקשר בדרך כלל לאתרי השחבור polypyrimidine-tract/3' של אינטרוני מודל עם זיקה קושרת (קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל או K_d) של בערך 1–10 ננומטר. לכן, בשני סבבי הקישור הראשונים ריכוז חלבון גבוה פי 10 מעל K_d עבור U2AF65; עבור חלבוני SXL ו-PTB, הריכוז ההתחלתי בטווח זה היה רק הניחוש הטוב ביותר שלנו. זה הבטיח שמיני רנ"א רצויים יוכלו להיקשר, אם כי רצפי זיקה נמוכים יותר היו קשורים גם הם באופן פוטנציאלי. בסבבים 3 ו-4 (שעתוק, קשירה והגברה) הופחת ריכוז החלבון פי שלושה. זה נעשה כדי לחסל בהצלחה מיני RNA בעלי זיקה נמוכה.
2. הניחו את הצינורות המכילים את תגובות הקישור למשך כ-30 דקות בטמפרטורה של 25°C בגוש טמפרטורה (או על קרח).
3. הפריד את הרנ"א המאוגד מהרנ"א הלא מאוגד במשך 4 הסבבים הראשונים של הגברת-בחירה באמצעות השלבים הבאים.
   1. סנן את הדגימה (100 μL) בטמפרטורת החדר דרך מסנן ניטרוצלולוז המחובר לסעפת ואקום.
      הערה: קומפלקס הרנ"א-חלבון, אך לא הרנ"א הבלתי קשור, נשאר על המסנן.
   2. קוצצים את המסנן עם RNA שנשמר לשברים עם סכין גילוח סטרילי; מכניסים אותם לצינור צנטריפוגה. לשחזר RNA על ידי סיבוב הצינור בעדינות במשך 3 שעות לפחות (או לילה) עם חתיכות מסנן שקוע במאגר proteinase K (PK).
   3. דה-פרוטאיזציה של דגימת הרנ"א על ידי ערבול שלה בנוכחות נפח שווה של פנול-כלורופורם (1:1) ולאחר מכן של כלורופורם. לשחזר את הפאזה המימית בכל פעם על ידי צנטריפוגה הדגימה במהירות גבוהה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. מערבבים אותו עם נתרן אצטט (0.1 נפח של 3.0 M, pH 5.2) ואתנול (2-3 כרכים של אתנול מוחלט, 200 הוכחה). השאירו את הצינור במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 30 דקות, צנטריפוגו אותו במהירות גבוהה למשך 10 דקות, ולאחר שלבי השטיפה והייבוש המסיסים את הרנ"א במים שטופלו ב-DEPC.
4. הפרד את שברי הרנ"א הקשורים לחלבון מהשברים הלא מאוגדים עבור 2 הסבבים האחרונים (סבבים 5 ו-6; שעתוק, קשירה והגברה) באופן הבא. הפחיתו את ריכוז החלבון בתגובת הקישור (שלב 1.1) פי שלושה נוספים ללחץ בחירה נוסף להעשרת רצפי קשירה בעלי זיקה גבוהה והעדיפו הסרה של רצפים בעלי זיקה נמוכה.
   1. יש ליצוק מראש ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי (5% עם יחס 60:1 אקרילאמיד:ביס-אקרילאמיד) במאגר TBE של 0.5x (Tris-Borate-EDTA) לפני הגדרת תגובת RNA:protein-binding (שלב 1.1) לעיל. אלקטרופורזה ג'ל זה בחדר קר (4 ° C) על ידי מריחת 250 V במשך 15 דקות.
   2. פיפטה RNA לעיל:תגובות קישור חלבון (שלב 1.1) לתוך בארות שונות של ג'ל זה.
      הערה: החלבון מאוחסן בטמפרטורה של -80°C ומדולל לפני השימוש ב-20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), pH 8.0, 20% גליצרול, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.05% NP-40 ו-1 mM dithiothreitol (DTT). תוספת של מעכב פרוטאז 0.5-1.0 mM פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF) היא אופציונלית. בתגובת הקשירה, חיץ זה תורם כ -6% גליצרול, המאפשר טעינה ישירה של דגימות לתוך הבארות ללא צורך לערבב אותם עם חיץ העמסת ג'ל נפרד.
   3. יש להפריד את הרנ"א הכבול מהרנ"א הלא קשור באמצעות אלקטרופורזה בג'ל בחדר קר (4°C) במתח של 250 וולט למשך שעה עד שעתיים. תהליך זה ידוע גם בשם gel mobility shift assay.
      הערה: משך האלקטרופורזה משתנה בהתאם לתכונות הרנ"א והחלבון המשמשים לקשירה.
   4. חשוף את הג'ל לסרט רנטגן וזהה את מיקום ה- RNA הכבול באמצעות אוטורדיוגרפיה. חותכים את פרוסת הג'ל עם RNA כרוך ולהכניס אותו לתוך צינור.
   5. יש לדגור על פרוסת הג'ל המרוסקת במאגר PK המשמש לפליטה למשך 3 שעות או למשך הלילה.
   6. מערבול את דגימת הרנ"א המדולל במרץ, תחילה עם פנול-כלורופורם ולאחר מכן עם כלורופורם.
   7. מערבבים נתרן אצטט ואתנול עם השלב המימי לאחר מיצוי כלורופורם. לאחר הדגירה במקפיא של -80°C, יש לסחור בטמפרטורה של 4°C למשך 5-10 דקות כדי לאסוף את כדורית ה-RNA. לשטוף את גלולת RNA עם אתנול ולייבש אותו באוויר על ידי השארת מכסה הצינור פתוח. ממיסים את הרנ"א במים שטופלו ב-DEPC.
      הערה: מעבר לבדיקת הסטת ניידות ג'ל לשבר מאפשר חיסול של מיני רנ"א לא רצויים שהיו עשויים להיות מועשרים לצורך קשירה, למשל, למסנן הניטרוצלולוז כאן (או לכל מטריצה) ששימש בסבבים הראשונים לשבר.

2. תמלול לאחור והגברת PCR

1. סנתז cDNA מהרנ"א המומס באמצעות שעתוק הפוך והפריימר ההפוך על ידי דגירה של תגובת 20 μL (2 μL של 10x RT Buffer, 2 μL של AMV reverse transcriptase, 1 μM reverse primer, 10 μL של RNA, מעכב RNase אופציונלי) ב 42 ° C למשך 60 דקות.
2. להגביר את cDNA באמצעות 20-25 מחזורי PCR. חבר את מקדם T7 RNA פולימראז לספרייה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המכילה תבנית ספרייה אקראית של 1 מיקרומטר DNA, 1 מיקרומטר מכל פריימר, 20 mM Tris (pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, אלבומין בסרום בקר 0.1 מיקרוגרם/μL אצטילאט, 2 יחידות של Taq פולימראז ו-200 מיקרומטר כל אחת של dNTPs (דאוקסיגואנוזין, Deoxyadenosine, deoxycytidine, ו deoxythymidine triphosphate).

3. שעתוק וקשירת חלבונים

1. חזור על התהליך של סינתזת RNA, קשירת חלבונים והפרדה של שברים הקשורים לחלבון, ובלתי קשורים.