תרמופורזה מיקרוסקופית לחקר אינטראקציות חלבון-שומנים בתמיסה

תקציר

מקור: Sparks, R. P. et al., שימוש בתרמופורזה בקנה מידה מיקרוסקופי למדידת אינטראקציות חלבון-שומנים.J. Vis. Exp.(2022)

סרטון זה מדגים תרמופורזה מיקרוסקולית לחקר האינטראקציה חלבון-שומנים. הבדיקה מזהה את האינטראקציה בין מולקולות על ידי כימות התנועה התרמופורטית של חלבונים המסומנים בפלואורסצנט בתגובה לשיפוע טמפרטורה. המולקולה הפלואורסצנטית מעורבבת עם ריכוזים שונים של מולקולות השומנים הלא פלואורסצנטיות, ותערובת המולקולות בתמיסה נטענת בנימים. על הדגימות בנימים מוחל שיפוע טמפרטורה, והתנועה של המולקולה הפלואורסצנטית בשיפוע הטמפרטורה מזוהה ונרשמת.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים

1. הכן מלח חוצץ פוספט (PBS): 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄, ו- 2 mM KH₂PO_4, pH 7.4.
2. מכינים צבע NTA-Atto 647 N. לדלל את מלאי NTA-Atto 647 N צבע ל 100 ננומטר מתמיסת 100% DMSO לתוך PBS ללא טווין.
3. Express Vam7-His8 – חלבון כחלבון פיוז'ן באי-קולי וטיהורו באמצעות Ni-NTA וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.
4. טיטר את האנליט במאגר PBS. אם האנליט נמצא במאגר אחר, MST המסומן אינו רגיש במיוחד להבדלי חיץ קלים ממולקולות כגון DMSO, אלא אם התוכן של מאגר האנליט מקיים אינטראקציה עם החלבון המסומן.

2. הכנת מכשיר MST

1. הפעל את מתג ההפעלה בגב ההתקן.
2. פתח את תוכנת הבקרה וודא שהמחשב הנייד פועל ומחובר למחשב המחובר להתקן.
3. הזן הגדרות פלואורסצנטיות ו- MST עבור ניסוי זה. הגדר את MST Before ל- 3 שניות, MST ל- 30 שניות ושחזור פלואורסצנטי (Fluo.)לאחר 1 שניות. לפני מדידת פלואורסצנטיות ראשונית ואינה דורשת זמן רב; MST הוא משך הזמן בפועל להשגת שיווי משקל לאחר השראת חום.
4. טבלת נימים: עבור כל צינור נימי, הזן את שם המטרה (ליגנד), שם הליגנד (אנליט), ריכוז המטרה וריכוז הטיטרציה הגבוה ביותר והשתמש ביחס הטיטרציה של מילוי אוטומטי. לדוגמה, הזן 50 ננומטר עבור ריכוז היעד של Vam7-His8, Vam7-His8 עבור שם היעד (1,2-dioctanoyl phosphatidic acid) Di-C8 PA עבור שם הליגנד, ואת הריכוז הגבוה ביותר של הליגנד בחירה 1:1 וגרירה כלפי מטה למילוי אוטומטי חריצים 2-16.
5. הפעל סריקת מכסה כדי לבחור את נורית ה-LED המתאימה (20% LED (מוגדרת מראש)) בהתבסס על האות של חלבון היעד והתאם בין 200 ל-2000 יחידות פלואורסצנטיות עבור MST המסומן. סריקות Cap צריכות להציג פסגות אחידות ומעוגלות בצורת פעמון.
6. בחר טווח של חזקות MST והזן ערכים עבור כל אחת מהן כדי לבדוק את התאמת האיגוד החזקה ביותר ולחץ על Start Cap Scan + Measurement, תוך סריקת ערכים שונים כדי לקבוע את תנאי ההפעלה הטובים ביותר עבור האינטראקציה הנתונה הנבדקת.
7. קבע את עוצמת MST עם ההתאמה הטובה ביותר באמצעות תוכנת הניתוח וההגדרה המוגדרת מראש עבור תרמופורזה עם Tjump. נתח התאמות בהתאם לרוב ההפרדה הפלואורסצנטית בין הריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר בהשוואה להספק MST עם ההתאמה הטובה ביותר ובחר את עוצמת MST לניסויים משוכפלים.
8. קבע אם התרחשה הלבנה בין ההפעלה הראשונה לשנייה על-ידי מעבר לתוכנת הניתוח והעברת הניתוח למצב מומחה. לאחר מכן, בחר פלואורסצנטיות במקום תרמופורזה לניתוח. בחר מצב מומחה ולאחר מכן photobleaching.

3. הכנת דגימות עבור MST מסומן

1. הביאו את תמיסת Vam7-His8 לריכוז של 200 ננומטר ב-PBS ללא טווין.
2. הביאו את צבע NTA-Atto 647 ל-100 ננומטר ב-PBS ללא טווין.
3. ערבבו את הצבע Vam7-His8 ו-NTA-Atto 647 ביחס נפחי של 1:1 ואפשרו לו לשבת בטמפרטורת החדר מכוסה באור למשך 30 דקות. קבעו את הריכוז המתאים של חלבון המטרה כמו בסעיף 2.5 (ראו תוספת על ניצול KD של צבע Ni-NTA כפי שהודגם בסרטון).
4. תערובת צנטריפוגות של צבע וחלבון NTA-Atto 647 N למשך 10 דקות בחדר חשוך באמצעות צנטריפוגה שולחנית בערך 8,161 x גרם.
5. אחסנו את התערובת בטמפרטורה של 4°C לאחר הניסוי או על קרח במהלך הניסוי לשימוש חוזר תוך מספר שעות במידת הצורך, על מנת למנוע דנטורציה של חלבון.
6. השתמש במאתר הריכוז NT כדי לקבוע את טווח הריכוז הדרוש לטיטרציה.
7. הביאו את Di-C8 PA לריכוז המרבי המתאים במים.
8. בצע טיטרציה של האנליט באמצעות דילול טורי ביחס של 1:1 במאגר PBS עבור 16 ריכוזים בהתבסס על השלב הקודם. שלא כמו SPR, תרמופורזה אינה רגישה להבדלי חיץ.

4. MST של דוגמאות

1. הפעל את ההתקן ואת המחשב הנייד המצורף.
2. לחץ על החץ למעלה בחזית המכונה והחלק את מתלה הנימים החוצה.
3. יש להעמיס נימים במדף עם הריכוז הגבוה ביותר במיקום 1.
4. בתוכנת הבקרה, בחר את הערוץ האדום המתאים ל- NTA-Atto 647 N.
5. הזן פרטי ריכוז, מיקום ושם עבור כל נימי דם בטבלת הנימים.
6. הפעל סריקה נימית על-ידי לחיצה על Start Cap Scan ב-20% LED (מוגדר מראש) וכוונן בהתאם בין 200 ל-2000 יחידות פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות עוצמת LED או ריכוז ליגנד (מסומן כחלבון).
7. בחר טווח של עוצמת MST.
8. התחל סריקת מכסה + מדידת MST.
9. נתח באמצעות תוכנת הניתוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Cy5 Maleimide צבע מונו-תגובתי	GE שירותי בריאות	PA23031	לסימון חלבונים
פריזמת GraphPad	תוכנת GraphPad
מונולית NT.115 נימים (ספירת 1000)	ננו-טמפר	MO-K022	נימים עבור MST
מכונת מונולית NT.115	ננו-טמפר		ציוד אוניברסיטאי
נת"ע-אטו 647 N	סיגמא	2175	תווית עבור התגים שלו
פוספטידילינוזיטול 3-פוספט diC8 (PI(3)P diC8)	אשלון	P-3008	שומנים לניסויי קשירה